Вступ

Сучасні протоколи інтенсивного лікування значно знизили смертність дітей від онкологічних захворювань із досягненням рівня 5-річної виживаності до 70%. Разом з тим, паралельно з успіхами онкопедіатрії збільшується проблема пізніх ускладнень лікування, що проявляються порушенням функціонування основних систем життєзабезпечення організму, і, зокрема, імунної системи [13–15]. Враховуючи нові інтенсивні програми лікування і сучасні методики імунодіагностики, актуальним є визначення ступеня імунологічних порушень як на етапах лікування, так і упродовж тривалого часу після його закінчення.

Сьогодні велика увага приділяється дослідженню активаційної дисфункції імунної системи в онкологічних хворих у зв’язку з розробкою й впровадженням більш ефективних методів лікування. Перспективним напрямком дослідження є визначення вмісту активованих лімфоцитів (з антигенами HLA-DR, CD25 або CD95) у периферичній крові онкологічних хворих.

Лімфоцити, які експресують HLA-DR- та CD25-антигени — це позитивно активовані лімфоцити. Така активація клітинної ланки призводить до реалізації її ефекторних функцій — антигенспецифічної цитотоксичності, стимуляції антитілоутворення та продукування цитокінів [2]. Кількість активованих Т-лімфоцитів збільшується при запальному процесі відповідно до ступеня його вираженості. Торпідний перебіг хронічних захворювань супроводжується зменшенням кількості активованих Т-лімфоцитів, що може свідчити про пригнічення реактивності імунної системи [11]. За даними деяких авторів [7, 16], зниження вмісту активованих Т-лімфоцитів у крові онкологічних хворих є несприятливою прогностичною ознакою. Винятком є регуляторні Т-клітини, які також експресують CD25-антиген, але при цьому здатні пригнічувати розвиток протипухлинної імунної відповіді [5, 12, 17].

Вміст CD95-лімфоцитів відображає рівень негативної активації й апоптозу лімфоцитів. Збільшення кількості клітин, які експресують цей маркер, корелює зі ступенем тяжкості запального процесу та імунодефіциту. Зниження експресії CD95-антигену на лімфоцитах характерно для лімфопроліферативних процесів [4, 7]. Ймовірно, порушення процесів регуляції позитивної й негативної активації може бути складовою імунопатогенезу злоякісних захворювань, тому визначення вмісту активованих лімфоцитів у крові онкологічних хворих у динаміці протипухлинного лікування є важливою складовою імуномоніторингу таких хворих [10, 18].

Рівень сироваткових імуноглобулінів основних класів (А, М, G) та циркулюючих імунних комплексів відображає функціональний стан гуморальної ланки імунної системи. Визначення даних показників у дітей допоможе оцінити, в першу чергу, можливості протиінфекційного імунного захисту організму.

Метою роботи було дослідити стан імунної системи дітей з прогностично несприятливими формами злоякісних новоутворень м’яких тканин (ЗНМТ) в динаміці комплексного лікування.

Матеріали та методи

За період 2007–2009 рр. в науково-дослідній лабораторії клінічної імунології Національного інституту раку проведено дослідження стану імунної системи у 42 дітей, хворих на ЗНМТ, віком від 3 міс до 18 років. Проведення досліджень було схвалено локальною комісією з питань етики Національного інституту раку МОЗ України.

За віком пацієнти були розподілені на групи — молодша (0–6 років) та старша (7–18 років); за перебігом хвороби — первинні хворі (хворі із вперше встановленим діагнозом, 32 пацієнти) та хворі, що закінчили лікування і знаходяться в стані ремісії (10 пацієнтів). Первинні хворі отримували поліхіміо­терапію (ПХТ) першої лінії за програмами CWS-96, EpSSG RMS 2005, EpSSG NRSTS 2005. Хворі, що закінчили лікування і перебували в стані ремісії, отримували ПХТ першої лінії за програмою CWS-96 та мали в анамнезі 4–15 курсів терапії із використанням цитостатиків в середньо-високих дозах (режими VAIA, CEVAIA).

Імунологічне обстеження первинних хворих проводили до початку лікування (1-й етап), після етапу локального контро­лю (2-й етап), безпосередньо після закінчення лікування (3-й етап), через 6 міс (4-й етап), через 1 рік (5-й етап) та через 2 роки після закінчення лікування (6-й етап). Хворих в стані ремісії обстежували безпосередньо після закінчення лікування (1-й етап), через 6 міс (2-й етап), через 1 рік після закінчення лікування (3-й етап).

Імунологічні дослідження включали кількісну оцінку різних субпопуляцій лімфоцитів периферичної крові (ЛПК) методом проточної цитофлуориметрії за допомогою панелі моноклональних антитіл, мічених флуоресцеїн-5-ізотіоціанатом, до СD3-, СD4-, СD8-, СD16-, СD20-, СD95-, HLA DR-антигенів («Сорбент», Російська Федерація) згідно з методикою [8]. Моноклональні антитіла з гепаринізованою кров’ю у співвідношенні 1:5 інкубували у темряві упродовж 30 хв при температурі 20–25 °С; додавали 2 мл лізуючого розчину та витримували 10 хв при тих же умовах. Потім клітини двічі відмивали забуференим ізотонічним розчином NaCl та фіксували 1% розчином параформальдегіду. Результати обчислювали на проточному цитофлуориметрі FACScan («Becton Dickinson», США) з використанням програми «Cell Quest». Гейт популяції клітин встановлювали на підставі комбінації прямого та бокового світлорозсіювання. Під час обліку результатів підраховували 2000 клітин у гейті.

Імунорегуляторний індекс (ІРІ) визначали як співвідношення СD4/СD8.

Визначення основних класів сироваткових імуноглобулінів (Ig) A, M, G проводили за допомогою методу радіальної імунодифузії; рівня циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) — методом селективної преципітації поліетиленгліколем 6000 [3].

Статистична обробка отриманих даних проведена із використанням Excel (МS Office 2003, XP) та програми STATISTICA 6,0 (StatSoft Inc., США). Під час порівняння показників двох незалежних груп при нормальному розподілі значень результатів вибірки застосовано t-критерій Ст’юдента, за відсутності нормального розподілу значень — U-критерій Манна-Уїтні. Статистичний аналіз показників групи в динаміці лікування здійснено за допомогою парного t-критерію у разі нормального розподілу значень та критерію Уілкоксона — при його відсутності [6].

Результати та обговорення

Дослідження стану імунної системи первинних хворих молодшої групи до початку лікування виявило її дисфункцію, що проявляється вірогідним зменшенням абсолютної кількості Т-лімфоцитів (CD3), в тому числі цитотоксичних Т-лімфоцитів (CD8), і В-лімфоцитів (CD20) відносно аналогічних показників у практично здорових дітей (р<0,05); проте ІРІ залишається в межах фізіологічної норми (табл. 1). Необхідно зазначити, що визначення аналогічних показників у дітей зі злоякісними пухлинами головного мозку [9] свідчить про збереження Т-клітинної ланки імунної системи відносно практично здорових дітей, проте суттєвим є збільшення кількості В-лімфоцитів і клітин з маркером ранньої активації (CD25).

Примітки:
Відмінності від показника у практично здорових дітей статистично вірогідні (р<0,05);
відмінності від показника до лікування статистично вірогідні (р<0,05).

Лікування, що проводиться, супроводжується пригніченням лейкопоезу у хворих цієї групи, що на етапі локального контролю, безпосередньо після нього, через 6 та 12 міс після його закінчення проявляється вірогідним зниженням кількості лейкоцитів відносно показників до лікування та вікової норми (див. табл. 1). Наслідком цього є суттєве зменшення на етапах лікування загальної кількості лімфоцитів, абсолютної кількості Т-лімфоцитів, в тому числі клітин з фенотипом CD4 та CD8(Т-хелпери та Т-супресори/цитотоксичні), а також В-лімфоцитів відносно показників до лікування та вікової норми (р<0,05). Безпосередньо після закінчення лікування порушується співвідношення субпопуляцій Т-лімфоцитів: ІРІ зменшується до 0,76, проте через 6 міс він відновлюється до величини вікової норми і зберігається таким до кінця строку спостереження.

У первинних хворих старшої вікової групи до лікування відмічали аналогічні зміни в імунній системі (табл. 2): на тлі зниження загальної кількості лімфоцитів відмічають зменшення абсолютної кількості CD3-, в тому числі CD8-лімфоцитів, а також В-лімфоцитів відносно показників вікової норми (р<0,05).

Примітки:
Відмінності від показника у практично здорових дітей статистично вірогідні (р<0,05);
відмінності від показника до лікування статистично вірогідні (р<0,05).

Вже на етапі локального контролю відзначаються більш глибокі порушення в імунній системі: абсолютна кількість CD3-лімфоцитів, в тому числі CD4- та CD8-лімфоцитів, та CD20- лімфоцитів вірогідно знижується порівняно з показниками до лікування (р<0,05). Безпосередньо після закінчення лікування вірогідно нижчим за показники до лікування залишається абсолютний вміст CD3-, CD4-, CD8- та CD20-лімфоцитів (р<0,05). Це обумовлює зменшення ІРІ до 0,98 безпосередньо після закінчення лікування. Абсолютна кількість лімфоцитів залишається вірогідно нижчою за вікову норму через 1 рік, а абсолютна Т-лімфопенія — і через 2 роки після закінчення лікування.

Враховуючи, що маркер CD25 є не тільки показником активації лімфоцитів, але й значною мірою маркером регуляторних Т-клітин, які перешкоджають ефективній імунологічній відповіді організму на пухлину [1], важливо відзначити, що на етапі локального контролю у цих хворих збільшується відносна кількість CD425-лімфоцитів.

Характерним для первинних хворих обох вікових груп є збільшення вмісту клітин, що несуть HLA-DR-антигени, та клітин, що експресують рецептор апоптозу (CD95). Ці показники на 2- та 3-му етапах спостереження вірогідно перевищують такі до лікування (див. табл. 1, 2). На етапах динамічного спостереження після закінчення лікування (4-, 5-, 6-й етапи) обидва показники знижуються до вихідних значень. Привертає увагу зменшення абсолютної кількості природних кілерних клітин (ПКК) на етапі локального контролю (р<0,05), але їх відносний вміст має тенденцію до збільшення; через 2 роки після закінчення лікування у дітей старшої групи суттєво збільшується відносна та абсолютна кількість ПКК.

Незважаючи на те що деякі автори повідомляють про незначні порушення в системі гуморальної ланки імунної системи на ранніх стадіях захворювання [13], ми отримали дещо інші результати. У хворих обох вікових груп вірогідно знижена абсолютна кількість В-лімфоцитів (див. табл. 1, 2). У хворих молодшої вікової групи на етапах динамічного спостереження після закінчення лікування відмічають гіпоімуноглобулінемію А, а рівні Ig М та G реєструються в межах вікової норми (табл. 3). У старшій групі виявляють підвищення вмісту Ig М до лікування та вірогідне зниження його на етапах лікування. Гіперімуноглобулінемія G реєструється через 1 рік після закінчення лікування (табл. 4).

Примітка:
відмінності від показника у практично здорових дітей статистично вірогідні (р<0,05).

Примітки:
відмінності від показника у практично здорових дітей статистично вірогідні (р<0,05);
відмінності від показника до лікування статистично вірогідні (р<0,05).

Рівень ЦІК у первинних хворих молодшої вікової групи відмічають у межах (1,87–2,64) мг/мл (див. табл. 3), старшої вікової групи — в межах (1,77–2,54) мг/мл (див. табл. 4). В обох групах цей показник упродовж лікування вірогідно не змінюється.

У хворих, що знаходяться в стані ремісії, відзначено вірогідне зменшення абсолютної кількості лімфоцитів безпосередньо після та через 6 міс після закінчення лікування (табл. 5). Ймовірно, зменшення їх кількості відбувається за рахунок Т-лімфоцитів, абсолютна кількість яких вірогідно зменшена безпосередньо після та через 6 міс після закінчення лікування. Проте, обидва показники відновлюються до величин у практично здорових дітей через 12 міс після закінчення лікування, в тому числі абсолютна кількість CD3- та CD4- лімфоцитів в цей строк вірогідно перевищує вихідні значення (р<0,05).

Примітки:
відмінності від показника у практично здорових дітей статистично вірогідні (р<0,05);
відмінності від показника до лікування статистично вірогідні (р<0,05);
відмінності від відповідного показника у первинних хворих старшої групи статистично вірогідні (р<0,05).

На відміну від первинних хворих, у яких на етапах динамічного спостереження після закінчення лікування відбувається зростання кількості ПКК, у хворих в стані ремісії відмічають зменшення їх відносної кількості, і через 1 рік після закінчення лікування їх вміст вірогідно менший за початковий рівень (р<0,05).

У хворих на ЗНМТ в стані ремісії в усі досліджувані періоди гуморальна ланка імунної системи залишається збереженою: кількість В-лімфоцитів та вміст Ig основних класів та ЦІК не відрізняються від аналогічних показників у практично здорових дітей (табл. 6).

Пацієнти, що закінчили лікування і знаходяться в стані ремісії, мають вірогідно більшу кількість лейкоцитів, Т-клітин, в тому числі CD4- та CD8-лімфоцитів, порівняно з групою первинних хворих (в обох групах безпосередньо після закінчення лікування). Через 1 рік після закінчення лікування хворі цих груп розрізняються (р<0,05) тільки за відносною кількістю CD4- та CD16- лімфоцитів.

Висновки

1. В імунній системі дітей, хворих на ЗНМТ, формуються порушення як в її клітинній, так і в гуморальній ланках, що проявляється зменшенням кількості CD3-, CD20-, CD4-, CD8-лімфоцитів в циркуляції на тлі зменшення загальної кількості лімфоцитів в периферичній крові та дисімуноглобулінемією. Наявність цих порушень може бути використана в якості показання для проведення реабілітації імунної системи.

2. Під впливом інтенсивної ПХТ порушення в імунній системі дітей, хворих на ЗНМТ, поглиблюються: на етапах лікування відмічають пригнічення показників, що характеризують стан клітинної ланки імунної системи, які не відновлюються через 1–2 роки після закінчення лікування.

3. У дітей, що закінчили повний курс лікування і знаходяться в стані ремісії, реєструють менші порушення клітинної ланки імунної системи безпосередньо після лікування, а через 12 міс після закінчення лікування всі досліджені показники відновлюються до рівня у практично здорових дітей. Порушень в гуморальній ланці імунної системи у цих хворих не зареєстровано.

4. Система природної резистентності є збереженою в обох досліджуваних групах хворих, зокрема, кількість CD16-клітин (ПКК) не відрізняється від відповідних показників у практично здорових дітей.

5. Виявлені порушення в імунній системі дітей з прогностично несприятливими формами ЗНМТ обґрунтовують необхідність імунореабілітації, яка може покращити ефективність їх основного лікування з подовженням безрецидивного періоду та збільшенням виживаності.

Література

• 1. Абрамов М.Е., Кадагидзе З.Г., Славина Е.Г. и др. (2006) Ингарон (интерферон гамма) в сочетании с химиотерапией в лечении онкологических больных. Фарматека,11: 38–42.
• 2. Вопросы современной проточной цитометрии. Клиническое применение (2008) Под ред. С.В. Хайдукова, А.В. Зурочки. Челябинск. 195 с.
• 3. Гриневич Ю.А., Каменец Л.Я. (1986) Основы клинической иммунологии опухолей. К.: Здоров’я, 158 с.
• 4. Капулер О.М., Нелюбин Е.В., Каут Д.А. и др. (2006) Апоптоз лимфоцитов при псориазе // Медицинская иммунология. 8(4): 531–538.
• 5. Козлов В.А., Ярилин А.А., Аметов А.С. и др. (2008) Естественные регуляторные Т-клетки и связанные с ними цитокины при хроническом аутоиммунном тиреоидите. Иммунология, 29 ( 6): 357–361.
• 6. Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. (2001) Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel. К.: Морион. 408 с.
• 7. Никулин Б.А. (2008) Оценка и коррекция иммунного статуса. М.: ГЭОТАР-Медиа. 376 с.
• 8. Пинегин Б.В., Ярилин А.А., Симонова А.В. и др. (2001) Применение проточной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека. М.: 5–10.
• 9. Хаматдинова З.Р., Хисамова Н.Ф., Хайруллина Р.М. (2010) Иммунологическая реактивность и ДНК-цитометрия клеток периферической крови при онкологических заболеваниях у детей. Мед. иммунология. 12( 1–2): 65–70.
• 10. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. (2009) Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний имммунной системы: руководство для врачей. М.: ГЭОТАР-Медиа: 352 с.
• 11. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тихонова М.А. и др. (2003) Феномен Т-клеточной анергии при хирургическом сепсисе. Мед. иммунология. Т. 5, 5–6: 529–538.
• 12. Ярилин А.А. (2007) Естественные регуляторные Т-клетки. Росс. мед. журн., 1: 43–48.
• 13. Abrahamsson J., Marky I., Mellander L. (1995) Immunoglobulin levels and lymphocyte response to mitogenic stimulation in children with malignant disease during treatment and follow-up// Acta Paediatr., 84(2): 177–82.
• 14. Alanko S., Pelliniemi T.T., Salmi T.T. (1994) Recovery of blood lymphocytes and serum immunoglobulins after treatment of solid tumors in children. Pediatr. Hematol. Oncol.,(1): 33–45.
• 15. Kotsakis A., Sarra E., Peraki M. et al. (2000) Docetaxel-induced lymphopenia in patients with solid tumors: a prospective phenotypic analysis. Cancer. 89(6): 1380–1386.
• 16. Schirrmacher V., Feuerer M., Beckhove P. et al. (2002) T Cell Memory, Anergy and Immunotherapy in Breast Cancer. J. of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 7( 2): 201–207.
• 17. Widen K., Mozaffari F., Choudhury A.et al. (2008) Overcoming immunosuppressive mechanisms. Annals of Oncology. 29 ( 7): 241–247.
• 18. Zitvogel L., Tesniere A., Kroemer G. (2006) Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion // Nature Rewies. Immunol. 6: 715–727.

Коментарів немає » Додати свій

Leave a comment

Ім’я (required)

Mail (will not be published) (required)

Сайт

CAPTCHA Code