Номер №4(28) 2017

Вплив модуляторів метаболізму аргініну і поліамінів на активність аргінази та продукцію оксидів азоту клітинами асцитного раку Ерліха in vivo

Яніш Ю.В., Артамонова А.Б., Залєток С.П.

Резюме. Показано, що дія інгібіторів метаболізму поліамінів може бути модифікована не тільки шляхом впливу на ферментні системи прямого синтезу останніх, але й шляхом зниження активності аргінази, задіяної в утворенні попередника синтезу поліамінів орнітину. Наявність інгібітору аргінази нораргініну створює сприятливі умови для роботи NO-синтаз, що викликає потужну стимуляцію продукції оксидів азоту пухлинними клітинами.

 Вплив модуляторів метаболізму аргініну і поліамінів на активність аргінази та продукцію оксидів азоту клітинами асцитного раку Ерліха <i>in vivo</i>

Вступ

Відомо, що проліферація клітин не може відбуватися за відсутності або навіть браку певної кількості поліамінів. Це стосується як нормальних, так і злоякісно трансформованих клітин. Тому пильна увага, яку приділяють онкологи обміну поліамінів в організмі, ураженому пухлинним процесом, та їх метаболізму безпосередньо в пухлинних клітинах не є випадковою. Зміни рівня поліамінів через штучне втручання в роботу ферментних систем, задіяних в їх синтезі або утворенні попередників цього синтезу, а також у процесі інтерконверсії, який дає клітині змогу залишатися живою за умов пригнічення прямого синтезу поліамінів, може стати ефективним важелем впливу на перебіг пухлинної хвороби [1–4]. Зокрема, від вмісту поліамінів залежить такий важливий показник, як сумарний поверхневий заряд і безпосередньо з ним пов’язаний електрокінетичний потенціал клітини [2, 5]. Ці біофізичні чинники впливають на функціональну активність клітин, у тому числі — клітин макрофагального ряду, які відіграють роль одного з перших бар’єрів неспецифічного захисту організму на початкових стадіях онкологічного захворювання [2]. Надалі пухлинна клітина стикається в організмі з клітинною ланкою імунного захисту, представники якої — цитотоксичні Т-лімфоцити та природні кілери — за сприятливих умов знищують її при безпосередньому контакті. У цих процесах задіяні вільнорадикальні механізми, головним фактором яких є активний кисень. А джерелом активних форм кисню зазвичай виступають оксиди азоту, зокрема NO. Проте продуцентами NO можуть бути також пухлинні клітини. Саме інтенсивність продукції ними цього вільного радикалу позначається на характері та динаміці перебігу онкологічного захворювання [6, 7]. Тому поглиблене вивчення дії модуляторів метаболізму аргініну і поліамінів на активність аргінази та продукцію оксидів азоту пухлинними клітинами має на меті створення у перспективі методів терапії та прогнозування перебігу онкологічних захворювань в експерименті — шляхом впливу на рівень поліамінів і моніторингу продукування NO у пухлинах.

Об’єкт і методи дослідження

Експерименти іn vivo виконували на нелінійних мишах розплідника віварію Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Тварин утримували за стандартних умов, вони мали вільний доступ до їжі та води. Як експериментальні пухлинні моделі використано карциному Ерліха (АРЕ). Тваринам із масою тіла 22–25 г вводили в черевну порожнину 0,2 мл ізотонічного розчину NaCl, що містив 3•105 клітин карциноми Ерліха (АРЕ).

Як модулятори метаболізму аргініну і поліамінів використані α-дифторметилорнітин (α-ДФМО) та рекомбінантна аргіназа, люб’язно надані доктором біологічних наук, професором М.В. Гончаром (Львівський інститут біології клітини НАН України); як інгібітор аргінази — норар­гінін. Нораргінін вводили в дозі 40 мг/кг маси тіла, ДФМО — у дозі 800 мг/кг, метилгліоксаль-біс-гуанілгідразон (МГБГ) — по 10 мг/кг; препарати вводили окремо або поєднано. Застосовували комбінації нораргініну з ДФМО та нораргініну з ДФМО і МГБГ. При поєднаному застосуванні препарати вводили з інтервалом 20 хв. Перші ін’єкції досліджуваних сполук робили через добу після перещеплення експериментальних пухлин, надалі — щодоби, до 7 введень. На 10-ту добу росту пухлини тварин забивали методом дисторсії шийних хребців із дотриманням правил біологічної етики.

Макрофагоподібні клітини вилучали з асцитної рідини, використовуючи їх здатність до адгезії з гладкою пластиковою поверхнею.

Продукцію оксиду азоту визначали таким чином: відбирали по 200 тис. пухлинних клітин у 100 мкл ізотонічного розчину NaCl, переносили в пробірки Епендорфа місткістю 1,5 мл та додавали по 100 мкл робочого розчину, який готували за 30 хв до початку досліду. Для приготування робочого розчину до колби, обгорнутої фольгою, додавали 24,3 мл бідистильованої (dd) Н2О, 735 мкл Н3РО4, 0,25 г сульфаніламіду та ретельно перемішували протягом 10 хв. Потім до розчину додавали 0,025 г нафтил-етилендіамін-дигідрохлориду та перемішували протягом 15 хв. Для побудови калібрувальної кривої готували стандартні розведення NaNO2, до яких також додавали по 100 мкл робочого розчину [8].

Після внесення до пробірок зі стандартами та дослідними зразками робочого розчину проби інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хв у захищеному від світла місці. Через 10 хв відбирали по 200 мкл розчину з кожної проби в плоскодонний планшет. Кожну пробу і стандарти вимірювали в трьох повторностях. Вміст оксидів азоту визначали за допомогою планшетного рідера при λ=545 нм [8].

Для визначення активності аргінази до відібраних пухлинних клітин (100 мкл суспензії, в яких містилося 200 тис. клітин) додавали 100 мкл 0,1% розчину Triton Х-100 та струшували проби протягом 15 хв. Потім додавали 100 мкл 50 мМ Тріс-НСl буферного розчину та 10 мкл 100 мМ розчину МnCl2. Зразки витримували протягом 10 хв на водяній бані при 60 °С, додавали по 100 мкл 0,5 М розчину аргініну та інкубували протягом 1 год у термостаті при 37 °С. За цей час готували стандартні розведення сечовини для побудови калібрувальної кривої [9].

Через годину до кожної дослідної проби додавали по 800 мкл суміші кислот Н3РО4, Н2SО4 та Н2О у співвідношенні 1: 3 : 7 відповідно, до стандартних проб додавали по 900 мкл суміші кислот і по 50 мкл α-ізопропіофенону та інкубували протягом 1 год на водяній бані при 100 °С; після інкубації відбирали по 200 мкл у плоскодонний планшет. Кожну пробу відбирали в трьох повторностях. Аргіназну активність вимірювали за допомогою планшетного рідера при λ = 570 нм; інтенсивність блакитного забарвлення у лунках планшета пропор­ційно залежала від кількості розщепленого ферментом аргініну [9].

Результати та їх обговорення

Показано, що застосування інгібітору аргінази (нораргініну) та інгібіторів синтезу поліамінів (ДФМО і МГБГ) у тварин із перещепленою карциномою Ерліха не призводило до суттєвих змін кількості макрофагоподібних клітин в асцитній рідині тварин. Кількість макрофагоподібних клітин у всіх досліджених групах тварин мало відрізнялася від цього показника у контрольних тварин із перещепленою карциномою Ерліха. У групі тварин, які отримували поєднано МГБГ, ДФМО та нораргінін, кількість макрофагів була навіть меншою порівняно з «хворим» контролем, але ця різниця була невірогідною (табл. 1). У цьому випадку увага, приділена визначенню вмісту макрофагоподібних клітин, пояснюється їх теоретично вагомим внеском у реакцію захисних систем організму на початкових етапах розвитку пухлини.

Таблиця 1. Вплив нораргініну та інгібіторів синтезу поліамінів на загальну кількість макрофагоподібних клітин в асцитній рідині тварин із карциномою Ерліха
Пухлинний штам Кількість макрофагоподібних клітин в асцитній рідині, n×106/тварину
Контроль Нораргінін МГБГ ДМФО Нораргінін + МГБГ + ДМФО ДФМО + МГБГ
АРЕ 473,0±81,5 627,9±159,3 515,7±91,4 727,0±305,7 366,4±71,8 564,4±90,8

Наступні експерименти стосувалися змін активності аргінази в пухлинних клітинах при введенні тваринам нораргініну та інгібіторів синтезу поліамінів (ДФМО і МГБГ).

Як видно з даних дослідження активності аргінази в клітинах карциноми Ерліха, наведених у табл. 2, введення нораргініну тваринам у сумарній дозі 40 мг/кг маси (7 ін’єкцій) викликало зниження активності аргінази на 14%. Поєднане введення тваринам усіх трьох досліджуваних інгібіторів (ДФМО + МГБГ + нораргінін) знижувало активність аргінази на 31%. Водночас введення лише інгібіторів синтезу поліамінів ДФМО і МГБГ окремо чи поєднано, навпаки, спричиняло деяке підвищення активності цього ферменту (на 15; 9 і 13% відповідно).

Таблиця 2. Вплив нораргініну та інгібіторів синтезу поліамінів на активність аргінази в клітинах АРЕ в експериментах in vivo
Пухлинний штам Активність аргінази, мкМ/106 клітин/год
Контроль Нораргінін МГБГ ДМФО Нораргінін + МГБГ + ДМФО ДФМО + МГБГ
АРЕ 1232,6±73,8 1059,2±92,1 1345,5±207,9 1418,2±11,4 852,3±145,7 1388,6±514,0

При дослідженні впливу інгібіторів синтезу поліамінів та інгібітору аргінази нораргініну на продукцію оксидів азоту клітинами карциноми Ерліха встановлено, що найбільшу кількість оксидів азоту продукують пухлинні клітини, вилучені у тварин, які отримували поєднано ДФМО, МГБГ і нораргінін. Показники продукції пухлинними клітинами оксидів азоту у цієї групи тварин перевищували такі в контрольній групі у 8 разів. При поєднаному введенні ДФМО та МГБГ цей показник був нижчим, ніж у попередній групі, однак достовірно вищим порівняно з контролем. Подібне явище мало місце і в групі тварин, що отримували нораргінін. При введенні тваринам ДФМО та МГБГ окремо кількість оксидів азоту, що продукувалася пухлинними клітинами, була також вищою порівняно з показниками у контролі, однак у випадку дії ДФМО це підвищення не досягало ступеня достовірності (табл. 3).

Таблиця 3. Вплив нораргініну та інгібіторів синтезу поліамінів на продукцію оксидів азоту клітинами АРЕ
Пухлинний штам Продукція оксидів азоту, мкМоль/106 клітин/год
Контроль Нораргінін МГБГ ДМФО Нораргінін + ДМФО + МГБГ ДФМО + МГБГ
АРЕ 314,2±55,1 624,6±52,6 434,0±48,6 372,7±20,2 1641,4±134,3 590,0±86,3

Висновки

1. Встановлено, що введення інгібітору активності аргінази (нораргініну) та інгібіторів синтезу поліамінів (ДФМО, МГБГ) тваринам із перещепленою карциномою Ерліха мало впливало на вміст макрофагоподібних клітин в асцитній рідині, і кількість останніх майже не відрізнялася від такої в пухлинному конт­ролі. Це може означати, що, принаймні у випадку з карциномою Ерліха, макрофагальна ланка неспецифічного захисту організму не відіграє істотної ролі.

2. Введення тваринам із перещепленою карциномою Ерліха нораргініну в дозі 40 мг/кг маси (7 ін’єкцій) призводить до зниження активності аргінази на 14%. Поєднане введення тваринам усіх трьох досліджуваних інгібіторів (ДФМО + МГБГ + нораргінін) викликає зниження активності аргінази на 31%. Водночас введення лише інгібіторів ферментів синтезу поліамінів ДФМО і МГБГ окремо чи поєднано, навпаки, спричиняє деяке підвищення активності цього ферменту (на 15; 9 і 13% відповідно). Ці дані цілком логічно пояснюються тим, що під дією ДФМО і МГБГ клітина компенсаторно підвищує активність аргінази з метою утворення надлишкової кількості орнітину як субстрату для орнітиндекарбоксилази, задіяної в синтезі поліамінів на початковому його етапі. Наявність у системі нораргініну пригнічує її активність, потенціюючи дію вказаних інгібіторів.

3. Введення тваринам із перещепленою карциномою Ерліха інгібіторів синтезу поліамінів (ДФМО, МГБГ) та інгібітору аргінази (нораргініну) викликає зміни у продукції оксидів азоту пухлинними клітинами. Найбільшу кількість оксидів азоту продукували пухлинні клітини, вилучені у тварин, які отримували поєднано ДФМО, МГБГ і нораргінін. Показники продукції пухлинними клітинами оксидів азоту у цієї групи тварин перевищували такі в контрольній групі у 8 разів. При поєднаному введенні ДФМО та МГБГ цей показник був нижчим, ніж у попередній групі, однак достовірно вищим порівняно з контро­лем. Подібні зміни були виявлені і в групі тварин, що отримували нораргінін. При введенні тваринам ДФМО та МГБГ окремо кількість оксидів азоту, що продукувалася пухлинними клітинами, була також вищою порівняно з показниками у контролі, однак у випадку дії ДФМО це підвищення не досягало ступеня достовірності. Очевидно, наявність вказаних інгібіторів, зокрема інгібітору аргінази, сприяло накопиченню надлишку аргініну, який відіграє роль субстрату для NO-синтаз. Саме це певною мірою може стимулювати продукцію оксидів азоту клітинами.

Таким чином, отримані дані свідчать, що відомі протипухлинні ефекти досліджених агентів можуть бути пов’язані з їх дією не тільки на ключові ферменти синтезу поліамінів — орнітиндекарбо­ксилазу та S-аденозилметіоніндекар­бо­­к­силазу, а й із їх впливом на ферменти обміну аргініну, зокрема аргіназу та синтазу оксидів азоту.

Список використаної літератури

1. Soda K. (2011) The mechanisms by which polyamines accelerate tumor spread. J. Exp. Clin. Cancer Res., 30: 95–99.

2. Яніш Ю.В., Гончар М.В., Артамонова А.Б., Карнаушенко О.В. (2015) Вплив модуляторів рівня аргініну і поліамінів на метаболічну активність макрофагів, цитолітичну активність спленоцитів та їх електрокінетичні властивості у мишей з лейкозом L1210. Клин. онкол., 2 (18): 47–51.

3. Rodriguez P.C., Quiceno D.G., Zabaleta J. et al. (2004) Arginase I production in the tumor microenvironment by mature myeloid cells inhibits T-cell receptor expression and antigen-specific T-cell responses. Cancer Res., 64: 5839.

4. Wheatley D.N., Campbell E. (2003) Arginine deprivation, growth inhibition and tumour cell death: 3. Deficient utilisation of citrulline by malignant cells. Brit. J. Cancer, 89: 573–576.

5. Яніш Ю.В., Гончар М.В., Гоголь С.В. та ін. (2015) Вплив модуляторів метаболізму аргініну і поліамінів на поверхневий електричний заряд клітин карциноми легені Lewis (LLC) in vivo та на їх проліферативну активність у культурі. Клин. онкол., 2 (18): 52–54.

6. Blachier F., Davila A.M., Benamouzig R., Tome D. (2011) Channelling of arginine in NO and polyamine pathways in colonocytes and consequences. Front. Biosci., 16: 1331–1343.

7. Nitric Oxide (NO) and Cancer/Prognosis, Prevention, and Therapy. Benjamin Bonavida Editor. Springer. New York, Dordrecht, Heidelberg, London, 2010. 513 р.

8. Miels A.M., Wink D.A., Cook J.C., Grisham M.B. (1996) Determination of nitric oxide using fluorescence spectroscopy. Methods Enzymol., 268: 105–120.

9. Kepka-Lenhart D., Ash D.E., Morris S.M. (2008) Determination of mammalian arginase activity. Methods Enzymol., 440: 221–230.

 

Влияние модуляторов метаболизма аргинина и полиаминов на активность аргиназы и продукцию оксидов азота клетками асцитного рака Эрлиха in vivo

Ю.В. Яниш, А.Б. Артамонова, С.П. Залеток

Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев

Резюме. Показано, что действие ингибиторов метаболизма полиаминов может быть модифицировано не только путем влияния на ферментные системы прямого синтеза последних, но и посредством снижения активности аргиназы, задействованной в образовании предшественника синтеза полиаминов орнитина. Наличие ингибитора аргиназы нораргинина создает благоприятные условия для работы NO-синтаз, что вызывает мощную стимуляцию продукции оксидов азота опухолевыми клетками.

Ключевые слова: карцинома Эрлиха, полиамины, макрофаги, аргиназа, NO, NO-синтазы.

Impact of arginine and polyamines metabolism modulators on the arginaze activity and nitrogen oxides production by cells of Ehrlich carcinoma in vivo

Yu.V. Yanish, A.B. Artamonova, S.P. Zaletok

R.E. Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology, NAS of Ukraine, Kyiv

Summary. It was shown that action of polyamine metabolism inhibitors can be modified not only by direct influence on the enzymatic system of synthesis the latter, but also by reducing arginase activity that is involved in the formation of ornithine the precursor of polyamine synthesis. The presence of an inhibitor of arginase norarginin creates favorable conditions for NO-synthase, which causes a strong stimulation of tumor cells production of nitrogen oxides.

Key words: Ehrlich carcinoma, polyamines, macrophages, arginase, NO, NO-syntases.

Адреса:
Яніш Юрій Вадимович
03022, Київ, вул. Васильківська, 45
Інститут експериментальної патології,
онкології і радіобіології
ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Тел.: (044) 259-91-95

Комментариев нет » Добавить свой
Оставить комментарий

ОШИБКА: Плагин «si-captcha.php» обнаружил, отсутствие поддержки GD image в PHP!

Свяжитесь с администратором вашего сервера или хостинга и выясните, почему не включена поддержка GD image в PHP.

Ошибка: Плагин «si-captcha.php» не может найти функцию «imagepng» в PHP!

Свяжитесь с администратором вашего сервера или хостинга и выясните, почему функция «imagepng» недоступна в PHP.