Проведено оцінку імунного статусу 87 хворих на меланому шкіри I-IV стадії. Встановлено, що з появою регіонарних та віддалених метастазів розвивається системна імунодепресія, морфологічним еквівалентом якої є прогресивне зменшення загальної кількості циркулюючих лімфоцитів з одночасним зменшенням кількості найбільш функціонально значимих субпопуляцій — Т-лімфоцитів і природних клітин-кілерів, що асоціюється із суттєвим збільшенням кількості регуляторних Т-клітин. Вже на перших стадіях захворювання виявляються ознаки активаційної дисфункції імунної системи: збільшена частка клітин, що експресують HLA-DR та CD25-антиген, з прогресуванням хвороби збільшується частка CD69- та CD95-лімфоцитів. Наявність імунологічних порушень необхідно враховувати при проведенні біотерапії у хворих на меланому шкіри.

Вступ

Меланома шкіри за рівнем захворюваності посідає 2-ге місце після раку шкіри серед новоутворень цієї локалізації, зумовлює найвищу летальність порівняно з іншими новоутвореннями шкіри та має більш високу швидкість росту, ніж інші солідні пухлини. За даними Національного канцер-реєстру Національного інституту раку МОЗ Украї­ни [8] у 2008 р. загальна кількість випадків меланоми шкіри становила 2731, що спричинило 1113 летальних випадків. Смертність до 1 року в 2007 р. в Україні становила 16,2 випадка на 100 тис. населення, 5-річна виживаність — від 90% при І стадії до 1–4% при ІV стадії захворювання. За даними American Joint Committee on Cancer (AJCC) у пацієнтів з меланомою високого ризику рецидиви виявляють в 20–60% випадків, а 5-річна загальна виживаність становить 45–70% [10].

Непрогнозованість клінічного перебігу меланоми (аж до спонтанної регресії), виникнення вітилігоподібної депігментації шкіри, об’єктивна відповідь на біотерапію дозволяють вважати, що імунна система відіграє важливу роль у наслідках цього захворювання [2]. Проте клінічно значущі зрушення в імунній системі хворих на меланому шкіри досі не визначені. Зокрема, дані щодо вмісту основних популяцій лімфоцитів периферичної крові у хворих на меланому шкіри мають доволі суперечливий характер [1, 3–7, 11, 12, 16,], втім, більшість результатів вказує на поглиблення порушень з боку як відносної, так і абсолютної кількості лімфоцитів при генералізації пухлинного процесу. Крім того, немає одностайної думки щодо експресії активаційних маркерів на лімфоцитах периферичної крові у хворих на меланому шкіри. Так, за даними одних авторів [7, 11, 14, 17], частка лімфоцитів, що експресують активаційні антигени, збільшується, в іншому випадку — автори не відмічають таких змін або відзначають лише для деяких маркерів [1, 3, 6]. Результати досліджень щодо вмісту природних регуляторних Т-клітин (Трег) у хворих на меланому шкіри також носять суперечливий характер. Вірогідне збільшення відносної та абсолютної кількості Трег у периферичній крові хворих на меланому шкіри виявлено G.C. Cesana та співавторами [13], в той час як M. Viguier та співавтори [19], вивчаючи вміст Трег у пацієнтів із метастазами меланоми в лімфатичних вузлах, не виявили розбіжностей за величиною цього показника у практично здорових людей (ПЗЛ).

Мета нашого дослідження — вивчення стану імунної системи у хворих на меланому шкіри залежно від стадії захворювання.

Об’єкт і методи дослідження

У дослідження включено 87 хворих з гістологічно підтвердженим діагнозом меланоми шкіри на різних стадіях захворювання (за класифікацією AJCC 2003 р.) та локалізацією первинної пухлини на шкірі тулуба та кінцівок. З них 36 пацієнтам (22 жінки та 14 чоловіків віком від 31 до 72 років) встановлено IА–IIС стадію, 15 (8 жінок та 7 чоловіків віком від 26 до 71 року) — ІІІ стадію та 36 (24 жінки та 12 чоловіків віком від 25 до 72 років) — IV стадію захворювання. Також було обстежено 35 ПЗЛ у тій же віковій групі.

Імунологічне дослідження периферичної крові хворих на меланому шкіри виконували до початку спеціального лікування. Визначали відносну та абсолютну кількість: лімфоцитів основних популяцій, Трег, В₁– та В₂-лімфоцитів, активованих лімфоцитів (CD69, CD95, HLA-DR, CD25), вміст у сироватці крові імуноглобулінів (Ig) основних класів А, М, G та циркулюючих імунних комплексів (ЦІК).

Кількість лейкоцитів у периферичній крові та лейкоцитарну формулу визначали загальноприйнятим методом. Імунофенотип лімфоцитів визначали методом проточної цитофлуориметрії за допомогою FACScan («Becton Dickinson», США) із використанням моноклональних антитіл до: CD3, CD19, CD4, CD8, CD16, HLA-DR, CD95, мічених флуоресцеїнізотіоцианатом («Сорбент», Росія); CD25, мічених фікоеритринцианіном-5 та CD127, CD69, CD5, мічених фікоеритрином («Beckman Coulter», США). Трег (CD4CD25CD127) визначали серед CD4-лімфоцитів за наявністю високої експресії CD25 в поєднанні з низькою чи негативною експресією CD127 [9, 15, 18]. Для визначення субпопуляцій В₁– та В₂-лімфоцитів застосовували двопараметричний аналіз із використанням лінійноспецифічного маркера В-лімфоцитів CD19 у поєднанні з CD5 [9].

Вміст імуноглобулінів основних класів А, М, G у сироватці крові досліджували методом радіальної імунодифузії за Манчіні, вміст ЦІК — методом селективної преципітації поліетиленгліколем 6000.

Статистична обробка отриманих даних проведена із використанням Excel (MS Office 2003, XP) та програми STATІSTІCA 6,0 (StatSoft Inc., США). Результати дослідження представляли у вигляді медіани та значень 10 та 90% квантилів (останні наведено у дужках). Для визначення вірогідності відмінностей (р) показників незалежних груп застосовували критерій Манна — Уїтні. Відмінності оцінювали як вірогідні при р<0,05.

Результати та їх обговорення

У пацієнтів із меланомою шкіри незалежно від стадії захворювання не виникає суттєвих змін з боку загальної кількості лейкоцитів у периферичній крові. Проте поява регіонарних або віддалених метастазів супроводжується перерозподілом вмісту формених елементів у лейкоцитарній формулі. Так, у хворих із генералізованою формою меланоми відносна кількість лімфоцитів менша при порівнянні з такою у групі ПЗЛ та хворими на первинно-локалізовану меланому (ПЛМ) (відповідно 23 (15; 34)% проти 33,5 (19,5; 49)% та 27 (17; 49,5)%; р<0,05), а відносний вміст нейтрофільних гранулоцитів — більший порівняно з цим показником у групі ПЗЛ (відповідно 55,5 (40; 69,5)% проти 61 (50,5; 70,5)%; р<0,05). При цьому суттєво зростає абсолютна та відносна кількість паличкоядерних нейтрофілів порівняно з показниками у ПЗЛ та у пацієнтів із меланомою І–ІІІ стадії. До того ж, у хворих із ІІІ та IV стадіями знижується абсолютний вміст лімфоцитів щодо цього показника у ПЗЛ (відповідно 1,37 (0,61; 2,02)·10/л та 1,30 (0,75; 1,83)·10/л проти 1,77 (1,13; 2,54)·10/л; р<0,05). На стадії генералізації процесу зменшення кількості лімфоцитів стає статистично вагомим при порівнянні з такою у хворих на ПЛМ (1,30 (0,75; 1,83)·10/л проти 1,44 (0,91; 2,35)·10/л; р<0,05).

Дослідження вмісту основних популяцій лімфоцитів (табл. 1) у хворих із різними стадіями меланоми показало, що суттєві зміни абсолютних показників виникають уже на ІА–ІІС стадії захворювання: зменшується кількість В-лімфоцитів (CD19) (0,10 (0,05; 0,22)·10/л проти 0,13 (0,08; 0,20)·10/л у ПЗЛ; р<0,05) та Т-клітин (CD3) (1,04 (0,56; 1,63)·10/л проти 1,24 (0,81; 1,93)·10/л у ПЗЛ; р<0,05). Проте з прогресуванням пухлинного процесу суттєвого зниження абсолютної кількості В- та Т-лімфоцитів не відбувається, і при ІІІ та IV стадії захворювання ці показники знаходяться майже на рівні значень у пацієнтів із ПЛМ. На ІА–ІІС стадії меланоми зміни абсолютної кількості Т-клітин відбуваються, перш за все, за рахунок зменшення кількості CD8-лімфоцитів (0,44 (0,19; 0,65)·10/л проти 0,53 (0,27; 0,79)·10/л у ПЗЛ; р<0,05), дефіцит цієї субпопуляції Т-лімфоцитів наростає з генералізацією пухлинного процесу, на IV стадії захворювання їх чисельність стає вірогідно нижчою, ніж у хворих на ПЛМ (відповідно 0,34 (0,18; 0,55)·10/л проти 0,44 (0,19; 0,65)·10/л; р<0,05). У хворих з регіонарними та віддаленими метастазами вірогідно зменшується і абсолютна кількість CD4-лімфоцитів, але лише щодо цього показника у групі ПЗЛ.

Відносна кількість CD3- та CD19- лімфоцитів у хворих на меланому шкіри не відрізняється від норми і залишається на однаковому рівні на всіх стадіях захворювання. Проте виникають зміни у субпопуляційному складі Т-клітин у осіб із IV стадією захворювання. У цій групі хворих збільшується частка СD4-лімфоцитів порівняно з такою у групі ПЗЛ (відповідно 45 (36; 57)% проти 42 (34; 48)%; р<0,05), внаслідок чого на фоні фізіологічних значень відносної кількості СD8-лімфоцитів з’являється тенденція до підвищення імунорегуляторного індексу. Дослідження субпопуляційного складу В-лімфоцитів не виявило суттєвої різниці у відсотковому вмісті В₁– та В₂-клітин у периферичній крові пацієнтів на різних стадіях захворювання. Аналогічні дані щодо збереження відносної кількості Т-лімфоцитів у хворих на меланому шкіри отримали Є.К. Олейник та співавтори [7]. Проте наші дані протирічать результатам цих досліджень про сталі значення субпопуляцій СD4та СD8 Т-лімфоцитів та збільшення СD19-лімфоцитів на всіх стадіях пухлинного процесу.

У хворих на ПЛМ та з метастазами у регіонарних лімфатичних вузлах абсолютна кількість природних клітин-кілерів (ПКК) (CD16) знаходиться на рівні цього показника у ПЗЛ. Проте поява віддалених метастазів супроводжується зменшенням загальної кількості СD16-лімфоцитів щодо значень цього показника у хворих на ПЛМ та у ПЗЛ (відповідно 0,19 (0,08; 0,33)·10/л проти 0,35 (0,14; 0,58)·10/л та 0,34 (0,24; 0,62)·10/л; р<0,05).

На ІА–ІІС стадії захворювання відносна кількість CD16-лімфоцитів вірогідно вища за норму (22 (15; 34)% проти 20 (14; 26)% у ПЗЛ; р<0,05), на ІІІ стадії цей показник знижується, досягаючи рівня у ПЗЛ, і на IV стадії (14 (9; 25)%) — значно нижчий, ніж у групі хворих на ПЛМ та ПЗЛ (р<0,05). Така динаміка змін кількості ПКК відповідає результатам, отриманим у пацієнтів із ПЛМ та генералізованою меланомою шкіри в Російському онкологічному центрі РАМН ім. М.М. Блохіна [3, 5].

Нами також досліджено вміст Трег у периферичній крові хворих на меланому шкіри (див. табл. 1). Абсолютна кількість цієї субпопуляції Т-лімфоцитів із розвитком пухлинного процесу на фоні поглиблення лімфоцитопенії залишається незмінною. Проте метастазування меланоми супроводжується суттєвим підвищенням відносного вмісту Трег порівняно з групою ПЗЛ (4,1 (1,6; 6,3)% при ІІІ та 4,0 (3,3; 5,1)% при IV стадії проти 2,8 (1,8; 3,8)% у ПЗЛ; р<0,05). Таким чином, відносний вміст Трег збільшується вже за наявності метастазів у регіонарних лімфатичних вузлах, а на IV стадії захворювання частка цих клітин вірогідно перевищує аналогічний показник у пацієнтів із ІА–ІІС стадії (р<0,05). Важливо відзначити, що збільшення кількості Трег на IV стадії захворювання супроводжується зменшенням кількості СD16-лімфоцитів, що можна пояснити здатністю Трег контролювати проліферацію та пригнічувати літичну та секреторну функції ПКК [13].

Дослідження фенотипу лімфоцитів за активаційними маркерами свідчить про збільшення частки лімфоцитів, що експресують активаційні антигени, у пацієнтів із метастатичним ураженням регіонарних лімфатичних вузлів або віддаленими метастазами (табл. 2). Абсолютна кількість активованих лімфоцитів залишається в межах фізіологічних значень на всіх стадіях захворювання, за винятком CD69-лімфоцитів, загальна кількість яких вірогідно зменшується у пацієнтів із меланомою IV стадії порівняно із такими при ІА–ІІС стадії. У хворих на ПЛМ вірогідно збільшена відносна кількість лімфоцитів, що експресують HLA-DR- та CD25-антигени, порівняно з такою у ПЗЛ. Частка CD95-лімфоцитів стає більшою за норму на стадії метастазування меланоми в регіонарні лімфатичні вузли (відповідно 62 (44; 85)% проти 54 (32; 66)% у ПЗЛ; р<0,05), а частка CD69-лімфоцитів — на IV стадії захворювання (35 (30; 43)% проти 27 (17; 39)% у ПЗЛ; р<0,05). Наявність віддалених метастазів у хворих асоціюється зі збільшенням відносної кількості HLA-DR-, CD25- та CD95-лімфоцитів порівняно із хворими на ПЛМ. Це не відповідає результатам М.Є. Абрамова та співавторів [1], які повідомляють про зменшення CD95-та незмінну кількість HLA-DR-лімфоцитів у хворих на генералізовану меланому шкіри.

Окремо проаналізовано вміст CD4CD25-лімфоцитів серед загальної популяції лімфоцитів крові, зокрема серед CD4-лімфоцитів (див. табл. 2). Частка CD4CD25-лімфоцитів вірогідно перевищує норму вже на ІА–ІІС стадії захворювання. У пацієнтів із генералізованою меланомою обидва показники вірогідно перевищують такі у хворих на ПЛМ. Пул CD4CD25-лімфоцитів включає в себе Трег, але збільшення відносної кількості Трег нами спостерігалося лише у пацієнтів із меланомою шкіри ІІІ стадії.

Вже на початку захворювання реєструється підвищений порівняно з ПЗЛ вміст ЦІК у периферичній крові пацієнтів із меланомою (табл. 3); генералізація процесу супроводжується прогресивним підвищенням показника як відносно ПЗЛ, так і порівняно із хворими на початкових стадіях пухлинного процесу (р<0,05).

Концентрація Ig G у сироватці крові хворих на ПЛМ та меланому з регіонарними метастазами підвищена порівняно з рівнем у ПЗЛ. Вміст Ig А та Ig М у сироватці крові пацієнтів незалежно від стадії захворювання спостерігається на рівні норми.

висновки

Узагальнюючи отримані результати, можна стверджувати, що у хворих на меланому шкіри з появою регіонарних та віддалених метастазів розвивається лімфоцитопенія, зумовлена зменшенням абсолютної кількості основ­них лімфоїдних популяцій. Відносні показники вмісту основних популяцій лімфоцитів не мають суттєвих змін, за винятком ПКК, частка яких збільшується на ранніх стадіях меланоми та різко зменшується при генералізації пухлинного процесу. Серед Т-лімфоцитів найбільш вразливою виявилась субпопуляція CD8-лімфоцитів, абсолютна кількість яких вірогідно зменшується вже на початкових стадіях пухлинного процесу. Такі імунологічні порушення на фоні метастазування свідчать про розвиток системної імунодепресії, морфологічним еквівалентом якої є прогресивне зменшення загальної кількості циркулюючих лімфоцитів з одночасним зменшенням у периферичній крові кількості найбільш функціонально значимих популяцій — Т-лімфоцитів і ПКК.

Метастатичне ураження регіонарного лімфатичного колектора супроводжується збільшенням відносної кількості Трег, проте частка CD4CD25-лімфоцитів, до складу яких належать і Трег, зростає вже при локалізованій меланомі. Паралельно зі зміною кількісних показників імунного статусу у хворих на меланому спостерігаються ознаки активаційної дисфункції імунної системи. Вже на перших стадіях захворювання підвищується відносна кількість клітин, що експресують HLA-DR- та CD25- антигени, в подальшому збільшується відносний вміст CD69- та CD95-лімфоцитів. У пацієнтів із генералізованою формою меланоми збільшена частка активованих лімфоцитів порівняно із хворими на ПЛМ. Реакція гуморального імунітету характеризується підвишенням концентрації Ig G та ЦІК вже на початкових стадіях хвороби. Адекватна оцінка ступеня виразності дисфункції імунної системи в її стадійному розвитку у хворих на меланому шкіри дозволить розробити імунологічні критерії прогнозу ефективності комплексного лікування, зокрема із застосуванням інтерферонів.

Література

• 1. Абрамов М.Е., Гуторов С.Л., Славина Е.Г. и др. (2009) Химиотерапия диссеминированной меланомы кожи с включением Ингарона. Клинико-иммунологические исследования. Рос. биотер. журн., 8(1): 64–74.
• 6. ДеВита В.Т., Хеллман С., Розенберг С.А. (ред.) (2002) Биологические методы лечения онкологических заболеваний. Принципы и практическое применение Медицина, Москва, 936 с.Борунова А.А., Чкадуа Г.З., Заботина Т.Н. и др. (2005) Иммунофенотип больных меланомой на фоне вакцинотерапии. Рос. биотер. журн., 4(1): 8.
• 16. Борунова А.А, Чкадуа Г.З., Заботина Т.Н. и др. (2005) Перфориновый потенциал эффекторных клеток у онкологических больных. Вестн. РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 16(3–4): 7–9.
• 29. Демидов Л.В., Богуш И.Г., Ившина А.В. (1997) Профилактическая иммунотерапия у больных меланомой кожи после хирургического лечения. Вестн. РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 8(1): 5–7.
• 36. Демидов Л.В., Харкевич Г.Ю., Тимофеев И.В. (2002) Результаты иммунопрофилактики метастазов меланомы кожи рекомбинантным гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором после хирургического иссечения первичной опухоли: динамика иммунологических и гематологических показателей. Рос. биотер. журн., 1(4): 49–53.
• 41. Олейник Е.К, Шибаев М.И., Олейник В.М. (2006) Маркеры активации лимфоцитов крови (CD25, CD71, CD95, HLA-DR) у онкобольных. Гематол. и трансфузиол., 51(1): 18–22.
• 47. Рак в Україні, 2008–2009 (2010) Захворюваність, смертність, показники діяльності онкологічної служби. З.П. Федоренко, А.В. Гайсенко, Л.О. Гулак та ін. Бюл. Національного канцер-реєстру України. Київ, № 11, 112 с.
• 55. Хайдуков С.В., Зурочка А.В., Тотолян А.А. и др. (2009) Основные и малые популяции лимфоцитов периферической крови человека и их нормативные значения (методом многоцветного цитометрического анализа). Мед. иммунол., 11(2–3): 227–238.
• 64. Balch C.M., Soong S.J., Atkins M.B. et al. (2004) An evidence-based staging system for cutaneous melanoma. CA Cancer J. Clin., 54(3): 131–149.
• 69. Campillo A., Martinez-Escribano J.A., Moya-Quiles M.R. et al. (2006) Natural killer receptors on CD8 T cells and natural killer cells from different HLA-C phenotypes in melanoma patients. Clin. Cancer Res., 12(16): 4822–4831.
• 76. Carpenter E.L., Mick R., Rech A.J. et al. (2009) Collapse of the CD27+ B-cell compartment associated with systematic plasmacytosis in patients with advanced melanoma and other cancers. Clin. Cancer Res., 15(13): 4277–4287.
• 83. Cesana G.C., DeRaffele G., Cohen S. et al. (2006) Characterization of CD4CD25 regulatory T cells in patients treated with high-dose interleukin-2 for metastatic melanoma or renal cell carcinoma. J. Clin. Oncol., 24(7): 1169–1177.
• 88. Dworacki G., Meidenbauer N., Kuss I. et al. (2001) Decreased ζ chain expression and apoptosis in CD3 peripheral blood T-lymphocytes of patients with melanoma. Clin. Cancer Res., 7: 947–957.
• 94. Liu W., Putman A.L., Xu-Yu Z. et al. (2006) CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+Treg cells. J. Exp. Med., 203(7): 1700–1711.
• 100. Menard C., Ghiringhelli F., Roux S. et al. (2008) CTLA-4 blockade confers lymphocyte resistance to regulatory T-cells in advanced melanoma: surrogate marker of efficacy of tremelimumab? Clin. Cancer Res., 14(16): 5242–5249.
• 105. Saito T., Dworacki G., Gooding W. et al. (2000) Spontaneous apoptosis of CD8 T-lymphocytes in peripheral blood of patients with advanced melanoma. Clin. Cancer Res., 6: 1351–1364.
• 110. Seddiki N., Santner-Nanan B., Martison J. et al. (2006) Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T-cells. J. Exp. Med., 203(7): 1693–1700.
• 117. Viguier M., Lemaître F., Verola О. et al. (2004) Foxp3 expressing CD4+CD25 Regulatory T-cells are overrepresented in human metastatic melanoma lymph nodes and inhibit the function of infiltrating T-cells. J. Immunol., 173: 1444–1453.

Коментарів немає » Додати свій

Leave a comment

Ім’я (required)

Mail (will not be published) (required)

Сайт

CAPTCHA Code