Номер Т. 9, № 1 (33) 2019

Частота и спектр мутаций гена KRAS у больных колоректальным раком в Украине

Полубень Л.А.1, Шкарупа В.Н. 1, Молеща Б.Т.1, Захарцева Л.М.2, Клименко С.В.1

Резюме. Определены частота и спектр мутаций в кодонах 12 и 13 гена KRAS у 131 пациента с колоректальным раком (КРР). Мутации KRAS выявлены у 56 больных (42,7%). Данные о частоте и спектре мутаций у больных КРР в Украине не отличаются от результатов генотипирования в исследованиях других авторов. Мутации гена KRASпри КРР в Украине встречаются чаще у женщин, чем у мужчин.

 Частота и спектр мутаций гена KRAS у больных колоректальным раком в Украине

Введение

Колоректальный рак (КРР) является одной из наиболее распространенных злокачественных опухолей в мире и второй по частоте причиной смерти от рака в странах Европы [1, 2, 9]. В последние годы многообещающими стали результаты лечения КРР при использовании моноклональных антител (МКАТ) против рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR). Препараты панитумумаб и цетуксимаб продемонстрировали высокую эффективность в монорежиме и в комбинации с оксалиплатином и иринотеканом при назначении в первой и во второй линии терапии больных метастатическим КРР [7, 8]. Предпосылкой к разработке препаратов явилось то, что EGFR гиперэкспрессирован в 50–80% случаев КРР, а его блокировка тормозит пролиферативную активность, адгезию, ангиогенез, миграцию и сокращает выживаемость опухолевых клеток [15]. Однако оказалось, что только у части пациентов (8–23%) отмечается желаемый эффект от лечения МКАТ, а уровень экспрессии EGFR опухолевыми клетками не коррелирует с ответом на терапию и не может использоваться как предик­торный маркер ее эффективности [10, 12]. Установлено, что неудачи лечения предопределяют мутации гена KRAS, при которых происходит EGFR-независимая активация внутриклеточного сигнального пути, делающая бесполезной блокировку самого рецептора [6].

Мутации KRAS выявляют в 35–45% случаев КРР [3]. К настоящему времени описано свыше 3000 точечных мутаций гена в клетках опухолей. Приблизительно 82 и 17% всех описанных мутаций KRAS обнаруживают в кодонах 12 и 13 соответственно. Проведенный анализ клинических данных свидетельствует, что только 3% больных КРР с наличием мутации KRAS в опухолевых клетках отвечают на лечение анти-EGFR МКАТ, в то время как у пациентов, опухоли которых экспрессируют нормальный (дикий) тип гена, этот показатель достигает 33% [13]. По этой причине определение мутационного статуса гена KRAS у больных КРР является ключевым моментом в планировании и прогнозировании ответа на таргетную терапию панитумумабом и цетуксимабом. Американское общество клинической онкологии и Европейское медицинское агентство одобрили и рекомендуют использование анти-EGFR МКАТ для лечения метастатического КРР исключительно у пациентов без мутации гена KRAS [4, 6].

Целью настоящего исследования было определить частоту и спектр мутаций гена KRAS у больных КРР в Украине.

Материалы и методы

Объектом исследования были 139 образцов опухоли больных КРР, которых лечили или направляли на диагностику в Киевский городской клинический онкологический центр. Для исключения ошибки отбора в исследование включили всех пациентов с КРР, направленных на тестирование мутационного статуса гена KRAS в отдел медицинской генетики ГУ «Национальный научный центр радиационной медицины НАМН Украины» на протяжении 2010–2012 гг. Среди пациентов — 35 мужчин и 104 женщины. Средний возраст составил 63,2 года.

Исследовали опухолевую ткань, полученную от пациентов при проведении оперативного вмешательства, фиксированную формалином и залитую в парафиновые блоки. Парафиновые блоки нарезали для получения 3–6-серийных срезов ткани толщиной 5–10 мкм и фиксировали на стеклах. Один из срезов окрашивали гематоксилин-эозином для патогистологической оценки и маркировки зон локализации опухолевых клеток. После депарафинизации в ксилоле проводили микро- или макродиссекцию 2–4 срезов ткани для получения суспензии клеток, содержащей не менее 70% опухолевых. ДНК выделяли с помощью наборов QIAamp DNA minikit (Qiagen, Германия) и Nucleospin Tissue DNA Mini-Kit (Duren, Германия) в соответствии с рекомендациями производителей. Мутационный статус гена KRAS изучали путем амплификации мутантной последовательности ДНК в присутствии супрессора нормальной аллели с одновременной маркировкой продукта полимеразной цепной реакции биотином c последующей избирательной гибридизацией специфического биотинилированного продукта на олигонуклеотидные пробы стрип-теста (KRAS StripAssay, ViennaLab, Австрия) в соответствии с рекомендациями производителя. Метод позволяет определить мутации, локализированные в 12-м (р.Gly12Ala, р.Gly12Arg, р.Gly12Asp, р.Gly12Cys, р.Gly12Ile, р.Gly12Leu, р.Gly12Ser, р.Gly12Val) и 13-м (р.Gly13Asp, р.Gly13Cys) кодонах 2-го экзона гена KRAS.

Статистические расчеты проводили с помощью программного пакета Statistica 5.5 (StatSoft, США). Данные оценивали с использованием критерия Фишера в двухстороннем варианте. Разницу между показателями оценивали как значимую при р<0,05.

Результаты

Из 139 образцов опухоли мутационный статус гена KRAS удалось проанализировать в 131 случае. В 8 случаях (5,8%) трехкратные попытки выделения и амплификации ДНК были безуспешными, что с наибольшей вероятностью обусловлено деградацией и химической модификацией ДНК клеток опухоли во время предшествующей гистологической проводки. Из 131 случая, в которых определение мутационного статуса KRAS было возможным, наличие мутаций в 12-м и 13-м кодонах гена выявлено в 56 (42,7%). В спектре определенных мутаций наиболее частой (35,7%, 20 из 56 больных с мутацией) оказалась замена глицина на аспартат в 12-м кодоне (р.Gly12Asp). Далее, по частоте представления, мутации расположились следующим образом: р.Gly12Val — 30,4% (17 из 56 больных с мутацией), р.Gly13Asp — 10,7% (6 из 56 больных), р.Gly12Ser — 8,9% (5 из 56 больных), р.Gly12Cys — 7,1% (4 из 56 больных), р.Gly12Ala — 5,4% (3 из 56 больных), р.Gly12Arg — 1,8% (1 из 56 больных). Ни в одном из случаев не были представлены 2 или более мутации одновременно.

Обсуждение

В настоящем исследовании мутационный статус гена KRAS определили у 139 пациентов с КРР. Поскольку, по данным опубликованных к настоящему времени работ, 97–99% мутаций гена KRAS приходятся на 12-й и 13-й кодоны, и только 1–3% мутаций определяются в 61-м и 146-м кодонах [5, 11], мы ограничились исследованием наиболее частых аномалий. Несмотря на многократные изменения методики, более частыми, чем ожидалось, были неудачи в проведении тестирования — в 8 из 139 случаев (5,8% против менее 5% предполагаемых), что, по нашему мнению, отражает особенности гистологической проводки образцов опухоли в нашей стране. Мутации гена KRAS обнаружены в образцах опухоли у 56 (42,7%) из 131 больного. Полученные данные сопоставимы с результатами генотипирования других авторов, согласно которым частота мутаций находится в диапазоне 35–45% [3, 9]. Не выявлено отличий в частоте мутаций также и при сравнении с данными аналогичного исследования, проведенного в Национальном институте рака МЗ Украины с использованием альтернативного метода тестирования (p=0,7) [2].

Данные о спектре мутаций гена KRAS при КРР в различных исследованиях приведены в таблице. По результатам всех исследований лидирующие позиции в спектре занимает триплет мутаций р.Gly12Asp, р.Gly12Val, р.Gly13Asp. Хотя соотношения частот отдельных мутаций, по сообщениям разных авторов, несколько отличаются между собой, статистически значимых различий как по их частоте, так и по спектру между данными сравниваемых работ нет.

Таблица Результаты определения мутационного статуса гена KRAS в различных исследованиях

Кодон Тип мутации KRAS Чаcтота мутации KRAS (% от всех мутаций гена)
По данным настоящего исследования По данным Н.Н. Храновской и соавторов [4] По данным J. Neumann и соавторов [6] По данным S. Christos и соавторов [5]
12 р.Gly12Asp 35,7 26 36 37,5
р.Gly12Val 30,4 19 21,8 28,1
р.Gly12Cys 7,1 15 8 5,3
р.Gly12Ser 8,9 11 6,5 9,9
р.Gly12Ala 5,4 4 6 6,4
р.Gly12Arg 1,8 4 1,3 1,2
13 р.Gly13Asp 10,7 22 18,8 11,7
р.Gly13Cys 0 0 0,8 0

В настоящем исследовании прослежена связь между полом больных КРР и частотой появления мутаций в гене KRAS. Оказалось, что среди больных женского пола уровень распространенности мутации KRAS гена выше, чем среди пациентов мужского пола (48%, 47 из 98 больных против 27,3%, 9 из 33 больных соответственно (р = 0,04)). Полученные результаты сопоставимы с данными исследования Hong Shen и соавторов [16], которые определили распространенность мутаций гена KRAS у мужчин и женщин, больных КРР, в Китае на уровне 44,7 и 28,2%. Однако, поскольку в крупном исследовании, включавшем 2721 пациента [14], не было установлено зависимости частоты мутации гена KRAS от пола, выявленные нами тенденции следует проверить на большем объеме выборки.

Результаты исследования свидетельствуют о значительной распространенности мутаций гена KRAS при КРР в Украине и подтверждают, что их частота и спектр в популяции больных нашей страны не отличаются от таковых среди жителей Западной Европы. Определение мутационного статуса гена KRAS у больных КРР должно быть ключевым моментом в планировании и прогнозировании ответа на терапию анти-EGFR МКАТ.

Выводы

1. Данные о частоте и спектре мутаций гена KRAS у больных КРР в Украине не отличаются от результатов генотипирования в исследованиях зарубежных авторов.

2. Мутации гена KRAS при КРР в Украине встречаются чаще у женщин, чем у мужчин.

3. В связи с непригодностью в большом числе случаев парафиновых блоков для исследования мутационного статуса гена KRAS рекомендовано при гистологической проводке образцов опухолей соблюдать условия, дающие возможность проведения в последующем молекулярно-генетических тестов.

Литература

1. Федоренко З.П., Гулак Л.О., Горох Є.Л. та ін. (2012) Рак в Україні 2009–2010. Бюлетень національного канцер-реєстру України, 12: 38–41.

2. Храновская Н.Н., Бесова Н.С. (2011) Таргетная терапия колоректального рака: место цетуксимаба (Эрбитукса). Здоровье Украины, 3(16): 16–17.

3. Alberto B., Salvatore S. (2010) Molecular mechanisms of resistance to cetuximab and panitumumab in colorectal cancer. J. Clin. Oncol., 28: 1254–61.

4. Allegra C.J., Jessup J.M., Somerfield M.R. et al. (2009) American society of clinical oncology provisional clinical opinion: testing for KRAS gene mutations in patients with metastatic colorectal carcinoma to predict response to anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody therapy. J. Clin. Oncol., 27(12): 2091–2096.

5. Karapetis C.S., Khambata-Ford S., Jonker D.J. et al. (2008) K-ras mutations and benefit from cetuxi­mab in advanced colorectal cancer. N. Engl. J. Med., 359: 1757–1765.

6. Ciardiello F., Tortora G. (2008) EGFR antagonists in cancer treatment. N. Engl. J. Med., 358: 1160–1174.

7. De Castro-Carpeno J., Belda-Iniesta C., Casado Sáenz E. et al. (2008) EGFR and colon cancer: a clinical view. Clin. Transl. Oncol., 10(1): 6–13.

8. Jean G.W., Shah S.R. (2008) Epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Pharmacotherapy, 28(6): 742–754.

9. Kahlenberg M.S., Sullivan J.M., Witmer D.D. et al. (2003) Molecular prognostics in colorectal cancer. Surg. Oncol., 12(3): 173–186.

10. Li Y.H., Wang F., Shen L. et al. (2011) EGFR fluorescence in situ hybridization pattern of chromosome 7 disomy predicts resistance to cetuximab in KRAS wild-type. Clin. Can. Res., 17(2): 121–133.

11. Linardou H., Briasoulis E., Mountzios G. et al. (2010) All about KRAS for clinical oncology practice: gene profile, clinical implications and laboratory recommendations for somatic mutational testing in colorectal cancer. Can. Treat. Rev., 1(27): 195–209.

12. Neumann J., Zeindl-Eberhart E., Kirchner T. et al. (2009) Frequency and type of KRAS mutations in routine diagnostic analysis of metastatic colorectal cancer. Patho­logy — Res. and Pract., 205: 858–862.

13. Raponi M., Winkler H., Dracopoli N. (2008) KRAS mutations predict response to EGFR inhibitors. Curr. Opin. Pharmacol., 8(4): 413–418.

14. Russo A., Bazan V., Agnese V. et al. (2005) Prognostic and predictive factors in colorectal cancer: Kirsten Ras in CRC (RASCAL) and TP53CRC collaborative studies. Ann. Oncol., 16(4): 44–49.

15. Salomon D.S., Brandt R., Ciardiello F. et al. (1995) Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies. Crit. Rev. Oncol. Hematol.,19: 183–232.

16. Yuan Y., Hu H.G., Shen H, Zheng S. (2010) K-ras gene mutation in colorectal cancer and its clinicopathologic significance. Zhonghua Waike Zazhi, 48: 1247–1251.

Частота та спектр мутацій гена KRAS у хворих на колоректальний рак в Україні

Л.О. Полубень1, В.М. Шкарупа1, Б.Т. Молеща1, Л.М. Захарцева2, С.В. Клименко1

1ДУ «Національний науковий центр радіаційної медицини Національної академії медичних наук України»

2Київський міський клінічний онкологічний центр

Резюме. Визначені частота та спектр мутацій у кодонах 12 і 13 гена KRAS у 131 пацієнта з колоректальним раком (КРР). Мутації KRAS виявлені у 56 хворих (42,7%). Дані про частоту та спектр мутацій у хворих на КРР в Україні не відрізняються від результатів генотипування в дослідженнях інших авторів. Мутації гена KRAS при КРР в Україні зустрічаються частіше у жінок, ніж у чоловіків.

Ключові слова: колоректальний рак, мутаційний статус, KRAS, частота, спектр.

The frequency and spectrum of KRAS gene mutations in Ukrainian patients with colorectal cancer

L.O. Poluben1, V.M. Shkarupa1, B.T. Molescha1, L.M. Zaharceva2, S.V. Klymenko1

1SI «National Research Center for Radiation Medicine of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine»

2Kyiv City Clinical Oncology Center

Summary. The frequency and spectrum of codons 12 and 13 of KRAS gene mutations was determined in 131 patients with colorectal cancer (CRC). Mutations of KRAS gene were present in 56 patients (42,7%). The frequency and spectrum of KRAS mutations found in the Ukrainian case series were similar to those observed in other studies. Female patients had a higher prevalence of gene mutation compared to male CRC cases.

Key words: colorectal cancer, mutation status, KRAS gene, frequency, spectrum.

Комментариев нет » Добавить свой
Оставить комментарий

ОШИБКА: Плагин «si-captcha.php» обнаружил, отсутствие поддержки GD image в PHP!

Свяжитесь с администратором вашего сервера или хостинга и выясните, почему не включена поддержка GD image в PHP.

Ошибка: Плагин «si-captcha.php» не может найти функцию «imagepng» в PHP!

Свяжитесь с администратором вашего сервера или хостинга и выясните, почему функция «imagepng» недоступна в PHP.