![]() |
![]() |
![]() |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Дослідження механізмів протипухлинного ефекту технології магнітної нанотерапії на моделі культур клітин злоякісних пухлин людини різного тканинного генезуОрел В.Е.1, Бездєнєжних Н.О.2, Лихова О.О.2, Ніколов М.О.1, Орел І.В.1, Романов А.В.1, Кудрявець Ю.Й.2, Щепотін І.Б.1
Резюме. Досліджено вплив доксорубіцину (ДР), магніточутливого нанокомплексу (МНК) з наночастинок Fe3O4 і ДР, електромагнітного опромінення (ЕО) та постійного магнітного поля (ПМП) на клітини злоякісних пухлин ліній А-549, Т-47D і HeLa S3. ЕО та ПМП найефективніше посилювали цитотоксичну дію ДР та МНК на клітини лінії А-549. Кількість позитивних клітин з ядерною локалізацією топоізомерази ІІα після дії магнітохімічних факторів різнилася залежно від тканинного генезу. У клітинах лінії Т-47D вплив магнітохімічних чинників ініціював зменшення кількості p21WAF1-позитивних клітин з ядерною локалізацією цього білка. Виявлено зменшення кількості β-катенінпозитивних клітин HeLa S3 внаслідок дії ДР, МНК, ЕО та ПМП.
|
№ з/п |
Варіант впливу | Клітинні лінії | ||
Т-47 D | A-549 | HeLa S3 | ||
живі клітини (відсоток від контролю) | ||||
1 | ДР | 46±2,2* | 42±3,2* | 54±1,8* |
2 | ДР + ЕО | 38±1,9*, | 35±2,4* | 29±2,0*, |
3 | ДР + ЕО + ПМП | 41±0,8*+ | 26±3,0*, | 47±3,8* |
4 | МНК | 43±3,0* | 35±3,6* | 38±0,4*, |
5 | МНК + ЕО | 39±2,0*, | 31±1,8*, | 37±2,6*, |
6 | МНК + ЕО + ПМП | 41±0,5*, | 28±1,2*, | 32±0,2*, |
*Статистично значущі відмінності порівняно з контролем з рівнем значущості р < 0,05; статистично значущі відмінності порівняно з ДР з рівнем значущості р < 0,05.
Імуноцитохімічний аналіз. Наступним етапом експерименту було дослідження на клітинному рівні впливу МНК, ЕО і ПМП на фенотипічний профіль клітин раку грудної залози, легені та шийки матки людини (табл. 2–4).
Таблиця 2. Вплив МНК, ЕО та ПМП на імунофенотипічний профіль клітин недрібноклітинного раку легені людини (лінія A-549)
№ з/п |
Варіант впливу |
Антиген/внутрішньоклітинна локалізація | |||||
Topo ІІ α | p21WAF1 | β-катенін | |||||
ЦП† | Ядерна | ЦП | Ядерна | ЦП | Ядерна | ||
1 | Контроль (без впливу) |
25,8±3,4 | 97,4±7,07 | 0 | 0 | 62,4±12,8 | 64,9±16,2 |
2 | ДР | 30,8±3,1 | 89,0±12,7 | 57,0±8,6* | 0 | 29,9±8,6* | 89,9±12,5 |
3 | ДР + ЕО | 7,8±0,9*, | 103,9±17,3 | 46,5±12,8* | 0 | 44,0±10,8 | 52,0±10,0 |
4 | ДР + ЕО + ПМП | 10,0±3,7*, | 108,9±13,6 | 25,6±12,8 | 0 | 95,0±18,6+ | 134,0±11,4*, |
5 | МНК | 14,1±3,4*, | 107,4±0,5 | 67,5±7,5* | 0 | 83,3±16,7+ | 103,2±29,5 |
6 | МНК + ЕО | 16,6±0,5*, | 91,6±21,7 | 48,0±8,5* | 0 | 33,8±7,2 | 70,8±15,3 |
7 | МНК + ЕО + ПМП | 27,1±4,2 | 63,5±14,1* | 54,0±5,77* | 0 | 31,0±7,1* | 67,0±17,8 |
ЦП† — локалізація антигену в цитоплазмі клітини; *статистично значущі відмінності порівняно з контролем з рівнем значущості р < 0,05; статистично значущі відмінності порівняно з ДР з рівнем значущості р < 0,05.
Таблиця 3. Вплив МНК, ЕО та ПМП на імунофенотипічний профіль клітин раку грудної залози людини (лінія T-47D)
№ з/п |
Варіант впливу |
Антиген/внутрішньоклітинна локалізація | |||||
Topo ІІ α | p21WAF1 | β-катенін | |||||
ЦП† | Ядерна | ЦП | Ядерна | ЦП | Ядерна | ||
1 | Контроль (без впливу) |
0 | 99,8±24,8 | 0 | 133,0±28,1 | 17,0±4,8 | 62,0±5,0 |
2 | ДР | 20,0±5,1* | 72,5±25,1 | 66,5±11,6* | 114,1±15,7 | 120,0±30,2* | 99,0±27,0 |
3 | ДР + ЕО | 0 | 30,0±11,4* | 22,0±8,6*, | 84,0±19,5 | 129,0±37,8* | 140,0±29,7* |
4 | ДР + ЕО + ПМП | 0 | 1,9±0,5*, | 70,0±15,7* | 125,0±13,2 | 17,0±5,0 | 70,0±14,5 |
5 | МНК | 0 | 93,5±19,8 | 27,0±9,4*, | 46,0±13,9*, | 83,0±13,2* | 134,0±22,8* |
6 | МНК + ЕО | 0 | 85,0±7,6 | 0 | 28,0±8,5*, | 65,0±11,4* | 91,0±26,3 |
7 | МНК + ЕО + ПМП | 0 | 79,5±23,5 | 12,0±3,5*, | 44,0±13,0*, | 2,5±2,5 | 55,0±5,7 |
ЦП† — локалізація антигену в цитоплазмі клітини; *статистично значущі відмінності порівняно з контролем з рівнем значущості р < 0,05; статистично значущі відмінності порівняно з ДР з рівнем значущості р < 0,05.
Таблиця 4. Вплив МНК, ЕО та ПМП на імунофенотипічний профіль клітин раку шийки матки людини (лінія HeLa S3)
№ | Варіант впливу | Антиген/внутрішньоклітинна локалізація | |||||
Topo ІІ α | p21WAF1 | β-катенін | |||||
ЦП† | Ядерна | ЦП | Ядерна | ЦП | Ядерна | ||
1 | Контроль (без впливу) |
43,5±5,0 | 50,4±11,0 | 26,6±2,1 | 67,5±9,7 | 79,1±7,3 | 94,9±15,4 |
2 | ДР | 17,0±1,5* | 84,8±14,4 | 32,4±5,6 | 22,2±2,0*,+ | 34,0±6,1* | 58,0±9,0 |
3 | ДР + ЕО | 45,8±3,5+ | 108,1±26,7 | 42,3±8,7 | 51,4±7,8+ | 51,2±8,2* | 39,1±7,0* |
4 | ДР + ЕО + ПМП | 85,0±7,8*,+ | 84,9±14,4 | 5,8±1,7*,+ | 14,1±3,0*,+ | 3,3±0,5*,+ | 37,4±10,9* |
5 | МНК | 69,6±28,8+ | 142,3±25,6*,+ | 1,7±0,8*,+ | 15,3±4,1* | 14,1±4,9*,+ | 41,6±16,3* |
6 | МНК + ЕО | 4,6±1,9*,+ | 133,1±14,36*,+ | 87,3±12,7*,+ | 76,6±21,4+ | 61,6±20,5 | 59,1±12,2 |
7 | МНК + ЕО + ПМП | 3,3±1,1*,+ | 102,3±7,21* | 33,7±7,5 | 79,0±18,9+ | 17,4±5,4* | 44,1±14,9* |
ЦП† — локалізація антигену в цитоплазмі клітини; *статистично значущі відмінності порівняно з контролем з рівнем значущості р < 0,05; +статистично значущі відмінності порівняно з ДР з рівнем значущості р < 0,05.
Топо ІІ α. Виявлено, що після дії ДР і МНК при ЕО зменшується кількість Топо ІІ α-позитивних клітин з локалізацією в цитоплазмі клітин А-549 в середньому на 53% відносно контролю. Обсяг Топо ІІ α-позитивних клітин відносно контролю в тих самих клітинах з ядерною локалізацією зменшувався на 35% лише після комплексної дії МНК, ЕО та ПМП. При дослідженні клітин лінії T-47D зареєстровано суттєве зниження рівня антигену в ядрах після комплексного впливу ДР, ЕО та ПМП до значення 1,9±0,5. У цитоплазмі клітин HeLa S3 зменшувалася кількість Топо ІІ α-позитивних клітин максимально на 92% відносно контролю при комплексній дії МНК, ЕО та ПМП. Зміни в кількості Топо ІІ α-позитивних клітин з ядерною локалізацією були найсуттєвішими в клітинах HeLa S3, при цьому відзначали суттєве збільшення (в середньому майже вдвічі відносно контролю) кількості позитивних клітин після дії всіх протипухлинних агентів. Отримані факти свідчать про відмінності впливу протипухлинних чинників залежно від генезу клітин, що потребує більш детального дослідження на клітинно-молекулярному рівні систем, що пов’язані з репарацією та лікарською стійкістю пухлинних клітин до протипухлинних агентів.
Білок p21WAF1. При дослідженні цього білка — регулятора клітинного циклу — найсуттєвішою відмінністю між різними варіантами впливу та типами клітин була поява невеликої кількості p21WAF1-позитивних клітин із локалізацією антигену в цитоплазмі клітини після будь-якої зовнішньої дії протипухлинних агентів на клітини А-549 та T-47D, окрім 6-ї групи. При використані МНК та ПМП з ЕО кількість клітин T-47D з експресією цього антигену в цитоплазмі зменшувалася на 88% більше, ніж після дії ДР та ПМП з ЕО. При впливі усіх досліджуваних чинників кількість p21WAF1-позитивних клітин з ядерною локалізацією в лінії T-47D зменшувалася в середньому на 45%. Це свідчить про зниження функціонування за таких умов цього білка як супресора. Стосовно клітин HeLa S3, то в цитоплазмі динаміка зміни кількості p21WAF1-позитивних клітин мала коливальний характер при послідовності дії чинників ДР → ДР + ЕО → ДР + ЕО + ПМП або МНК → МНК + ЕО → МНК + ЕО + ПМП з максимумом після ЕО. В ядрі антиген знижувався в 2–4-й групах із використанням ДР та в 5-й групі при самостійному впливі МНК — у середньому на 62% (р<0,05).
Білок β-катенін. У клітинах лінії А-549 у дослідах із ДР виявлено збільшення кількості β-катенінпозитивних клітин (з локалізацією білка в цитоплазмі) під впливом ЕО або ЕО + ПМП з 29,9±8,6 до 44,0±10,8 та 95,0±18,6 відповідно (р<0,05), у той час як у дослідах із МНК вплив ЕО або комбінація ЕО + ПМП, навпаки, зменшували їх кількість до 31,0±7,1 (р<0,05). При використанні МНК тенденція до зниження експресії білка в ядрі відносно самостійного впливу препарату, як і в цитоплазмі під впливом зовнішніх чинників, збереглася. Виявлено, що після дії ДР, МНК та при поєднаному впливі з ЕО відзначають суттєве збільшення кількості β-катенінпозитивних клітин T-47D (з локалізацією білка в цитоплазмі), при цьому додатковий вплив ПМП значно знижував експресію цього білка (4-та, 7-ма групи). При дослідженні клітин іншого генезу (HeLa S3) виявлено тенденцію до зменшення кількості позитивних клітин і з ядерною, і з цитоплазмовою локалізацією β-катеніну при будь-яких комплексах використаних протипухлинних чинників. Особливо значним було зменшення кількості β-катенінпозитивних клітин HeLa S3 при комбінованій дії ЕО + ПМП (4-та, 7-ма групи).
Для детальнішого розуміння особливостей впливу ЕО і ПМП на пухлинні клітини необхідне додаткове вивчення експресії β-катеніну в комплексі з іншим білком адгезії — Е-кадгерином, оскільки відомо, що у разі пригнічення експресії Е-кадгерину β-катенін у незв’язаному з Е-кадгерином стані є нестабільним, внаслідок чого вільного β-катеніну стає настільки багато, що системи його деградації не виконують своєї функції та частина β-катеніну релокалізується в ядро, де він проявляє свою транскрипційну активність [11].
Таким чином, отримані дані з використанням технології магнітної нанотерапії свідчать про відмінності у впливі досліджених магнітохімічних чинників залежно від типу клітин, оскільки вони по-різному викликають релокалізацію певних антигенів. Імовірно, це сприяє зміні функціонування останніх. Ці факти у фундаментальному аспекті свідчать про вплив магнітохімічних факторів на стохастичні процеси клітинної сигналізації пухлинних клітин та потребують кінетичного дослідження фенотипу пухлинних клітин для вірогідного прогнозування подальшої їх поведінки — інгібіції чи стимуляції проявів злоякісного фенотипу за характеристикою їх інвазійних/міграційних властивостей та стану білків, що асоційовані з лікарською стійкістю. У прагматичному аспекті отримані результати засвідчили перспективність подальшого проведення доклінічних досліджень технології магнітної нанотерапії в дослідах з експериментальними злоякісними пухлинами тварин.
1. Встановлено, що ЕО та ПМП посилюють дію ДР на пухлинні клітини при їх комбінованому застосуванні, знижуючи їх виживаність. Найбільш ефективно ці протипухлинні чинники впливають на клітини недрібноклітинного раку легені людини (лінія А-549) і в експериментах із МНК.
2. Встановлено, що при дії на пухлинні клітини магнітохімічних факторів відбувається зміна кількості Topo ІІ α-позитивних клітин з ядерною локалізацією антигену. Кількість позитивних клітин суттєво різнилася залежно від тканинного генезу: значне зменшення кількості Topo ІІ α-позитивних-клітин відзначали серед клітин раку грудної залози Т-47D, хоча серед пухлинних клітин шийки матки HeLa S3 відмічено суттєве збільшення кількості Topo ІІ α-позитивних-клітин, а в клітинах лінії раку легені людини А-549 зміни в експресії цього антигену не виявлено, за винятком їх зниження в досліді з використанням МНК і поєднаного впливу ЕО та ПМП.
3. Дослідження p21WAF1-позитивних клітин Т-47D з ядерною локалізацією білка засвідчило, що всі магнітохімічні чинники ініціювали зменшення кількості позитивних клітин, а в подібних експериментах із клітинами ліній HeLa S3 досліджувані зміни мали коливальний характер.
4. Встановлено зменшення кількості β-катенінпозитивних клітин HeLa S3 внаслідок дії ДР, МНК і впливу ПМП та ЕО. У клітинах іншого генезу відзначали релокалізацію цього антигену, а кількість позитивних клітин зменшувалася або зростала залежно від дії певних комплексів протипухлинних чинників.
Национальный институт рака, Киев
Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев
Резюме. Исследовано влияние доксорубицина (ДР), магниточувствительного нанокомплекса (МНК) из наночастиц Fe3O4 и ДР, электромагнитного облучения (ЭО) и постоянного магнитного поля (ПМП) на злокачественные клетки линии А-549, Т-47D и HeLa S3. ЭО и ПМП наиболее эффективно усиливали цитотоксический эффект действия ДР и МНК в клетках линии А-549. Количество положительных клеток с ядерной локализацией топоизомеразы ІІα после действия магнитохимических факторов отличалось в зависимости от генеза исследуемых клеток. В клетках линии Т-47D влияние магнитохимических факторов инициировало уменьшение количества p21WAF1-положительных клеток с ядерной локализацией этого белка. Установлено уменьшение количества β-катенинположительных клеток HeLa S3 после воздействия ДР, МНК, ЭО и ПМП.
культуры клеток злокачественных опухолей, магнитная нанотерапия, магниточувствителый нанокомплекс, доксорубицин.
Адреса:
Орел Валерій Еммануїлович
03022, Київ, вул. Ломоносова, 33/43
Національний інститут раку МОЗ України
Тел.: (044) 257-60-68
Е-mail: v-orel@i.com.ua
Leave a comment