Номер Т. 9, № 3 (35) 2019

Значення експресії колагену IV типу, Ki-67 і ММР-9 у м’язово-неінвазивному уротеліальному раку сечового міхура для прогнозу перебігу захворювання

Яковцова І.І., Титов Е.В., Ивахно И.В., Долга О.В., Данилюк С.В.

Резюме. Рак сечового міхура (РСМ) в 70–80% випадків діагностують на м’язово-неінвазивній стадії, при цьому рецидиви виникають у майже 70% пацієнтів. У рутинній діагностиці неінвазивного уротеліального раку сечового міхура (НУРСМ) (стадії T1) імуногістохімічне дослідження може дати об’єктивну оцінку біологічної поведінки пухлини, а також служити критеріями прогнозу перебігу захворювання. Мета дослідження — вивчення експресії маркерів Ki-67, матриксної металопротеїнази-9 (matrix metalloproteinase-9 — ММР-9) і колагену IV типу в НУРСМ для виявлення критеріїв прогнозу рецидивування і прогресії захворювання. Об’єкт і методи дослідження. Сформовані дві групи дослідження: НУРСМ без рецидивування — I група (14 випадків), первинні НУРСМ з рецидивуванням без прогресії — II група (14 випадків) та первинні НУРСМ з рецидивуванням і прогресією у вторинні пухлини у вигляді інвазії в м’язовий шар стінки — III група (14 випадків). Імуногістохімічне дослідження проводилося з використанням первинних моноклональних антитіл фірми DAKO до колагену IV типу, ММР-9 і Ki-67. Показники експресії маркерів, пов’язаних з імунною відповіддю, вивчали в трьох полях зору мікроскопа на гістологічних зрізах із найбільш вираженою експресією при збільшенні ×400. Підрахунок кількості експресуючих маркери клітин проводився на мікроскопі Primo Star з фотокамерою при збільшенні об’єктива 400 за допомогою програми Adobe Photoshop CS6. Площа тестування становила 0,057 мм² (57 000 мкм²). Для оцінки імуногістохімічної реакції використовували напівкількісну шкалу від 0 до 3 з урахуванням відсот­ка експресуючих маркер клітин в полі зору. Реакція на Ki-67: 1 бал — до 20% пухлинних клітин у полі зору, 2 бали — 20–50% пухлинних клітин, 3 бали — більше 50% пухлинних клітин. Реакція на колаген IV типу: 0 — відсутність реакції або експресія в менше ніж 5% площі пухлини, 1 бал — слабка, переривчаста експресія маркера, 2 бали — безперервне чітке фарбування базальних мембран. Реакція на ММР-9: 1 бал — до 50% пухлинних клітин, 2 бали — більше 50% пухлинних клітин різного ступеня інтенсивності, 3 бали — інтенсивна експресія 100% пухлинних клітин. Результати та їх обговорення. Для НУРСМ високого ступеня злоякісності характерна експресія Ki-67 більше 20% пухлинних клітин (р<0,0001), виражена експресія MMP-9 (р<0,05) і відсутність реакції на колаген IV типу (р<0, 01), що визначає ці маркери як критерії злоякісності НУРСМ. У I групі НУРСМ експресія Ki-67 і ММР-9 нижче, ніж в III (р<0,01 і р<0,03 відповідно). Слабка експресія ММР-9 і Ki-67 (до 20% пухлинних клітин) характерна для I групи (р<0,03 і р<0,005 відповідно), виражена експресія Ki-67 (більше 50% пухлинних клітин) — для III групи (р<0,03). Простежена пряма кореляційна залежність між експресією Ki-67 і ММР-9 (р<0,01) і зворотна залежність між експресією Ki-67 і колагену IV типу (р<0,01), ММР-9 і колагену IV типу, що характеризує взаємозв’язок процесів підвищення проліферативної активності ракових клітин зі зростанням їхньої здатності до продукування металопротеїназ і руйнування екстрацелюлярного матриксу, та колагену IV типу зокрема. Ці зміни призводять до більш агресивної біологічної поведінки пухлини і можуть служити критеріями прогнозу захворювання.

Резюме. Рак мочевого пузыря (РМП) в 70–80% случаев диагностируют на мышечно-неинвазивной стадии, при этом рецидивы возникают у порядка 70% пациентов. В рутинной диагностике неинвазивного уротелиального рака мочевого пузыря (НУРМП) (стадии T1) иммуногистохимическое исследование может дать объективную оценку биологическому поведению опухоли, а также служить критерием прогноза течения заболевания. Цель исследования — изучение экспрессии маркеров Ki-67, матриксной металлопротеиназы-9 (matrix metalloproteinase-9 — ММР-9) и коллагена IV типа в НУРМП для выявления критериев прогноза рецидивирования и прогрессии заболевания. Объект и методы. Сформированы две группы исследования: НУРМП без рецидивирования — I группа (14 случаев), первичные НУРМП с рецидивированием без прогрессии — II группа (14 случаев) и первичные НУРМП с рецидивированием и прогрессией во вторичной опухоли в виде инвазии в мышечный слой стенки — III группа (14 случаев). Иммуногистохимическое исследование проводилось с использованием первичных моноклональных антител фирмы DAKO к коллагену IV типа, ММР-9 и Ki-67. Показатели экспрессии маркеров, связанных с иммунным ответом, изучали в трех полях зрения микроскопа на гистологических срезах с наиболее выраженной экспрессией при увеличении ×400. Подсчет количества экспрессирующих маркеры клеток проводился на микроскопе Primo Star с фотокамерой при увеличении объектива ×400 раз с помощью программы Adobe Photoshop CS6. Площадь тестирования составила 0,057 мм2 (57 000 мкм2). Для оценки иммуногистохимической реакции использовали полуколичественную шкалу от 0 до 3 с учетом процента экспрессирующих маркер клеток в поле зрения. Реакция на Ki-67: 1 балл — до 20% опухолевых клеток в поле зрения, 2 балла — 20–50% опухолевых клеток, 3 балла — более 50% опухолевых клеток. Реакция на коллаген IV типа: 0 — отсутствие реакции или экспрессия в менее 5% площади опухоли, 1 балл — слабая, прерывистая экспрессия маркера, 2 балла — непрерывное четкое окрашивание базальных мембран. Реакция на ММР-9: 1 балл — до 50% опухолевых клеток, 2 балла — более 50% опухолевых клеток различной степени интенсивности, 3 балла — интенсивная экспрессия 100% опухолевых клеток. Результаты и их обсуждение. Для НУРМП высокой степени злокачественности характерна экспрессия Ki-67 более 20% опухолевых клеток (р<0,0001), выраженная экспрессия MMP-9 (р<0,05) и отсутствие реакции на коллаген IV типа (р<0,01), что определяет эти маркеры как критерии злокачественности НУРМП. В I группе НУРМП экспрессия Ki-67 и ММР-9 ниже, чем в III (р<0,01 и р<0,03 соответственно). Слабая экспрессия ММР-9 и Ki-67 (до 20% опухолевых клеток) характерна для I группы (р<0,03 и р<0,005 соответственно), выраженная экспрессия Ki-67 (более 50% опухолевых клеток) — для III группы (р<0,03). Прослежена прямая корреляционная зависимость между экспрессией Ki-67 и ММР-9 (р<0,01) и обратная зависимость между экспрессией Ki-67 и коллагена IV типа (р<0,01), ММР-9 и коллагена IV типа, что характеризует взаимосвязь процессов повышения пролиферативной активности раковых клеток с возрастанием их способности к продуцированию металлопротеиназ и разрушению экстрацеллюлярного матрикса, и коллагена IV типа в частности. Эти изменения приводят к более агрессивному биологическому поведению опухоли и могут служить критериями прогноза заболевания.

Получено 14.02.2019
Принято в печать 04.04.2019

DOI: 10.32471/clinicaloncology.2663-466X.38.22293

Рак мочевого пузыря (РМП) является наиболее частым злокачественным новообразованием мочевыводящих путей [1, 2]. В 70–80% случаев РМП диагностируют на мышечно-неинвазивной стадии, при этом рецидивы возникают у порядка 70% пациентов [3]. Для прогноза рецидивирования и прогрессии неинвазивного уротелиального РМП (НУРМП) (стадии T1) одним из основных критериев является дифференцировка опухоли. Однако этот критерий не всегда отображает характер клинического поведения опухоли и относится к субъективным признакам, то есть зависит от интерпретации данных патоморфологом. Иммуногистохимическое исследование может служить более надежным методом прогноза заболевания. Среди онкомаркеров, используемых для диагностики РМП, представляют интерес индекс пролиферации Ki-67, определяющий активность опухолевого роста, матриксная металлопротеиназа-9 (matrix metalloproteinase-9 — ММР-9), свидетельствующая об инвазивном потенциале опухоли, ее способности разрушать компоненты экстрацеллюлярного матрикса, в том числе базальную мембрану [4, 5], и коллаген IV типа, в норме являющийся компонентом базальных мембран, потеря экспрессии которого связана с характером роста, инвазией, утратой способности опухоли к формированию дифференцированных структур [6].

Целью исследования явилось изучение экспрессии иммуногистохимических маркеров Ki-67, ММР-9 и коллагена IV типа в НУРМП с целью выявления критериев прогноза рецидивирования и прогрессии заболевания.

Объект и методы исследования

Материалом исследования явились оперативно удаленные в Харьковском областном клиническом центре урологии и нефрологии имени В.И. Шаповала 42 уротелиальных новообразования мочевого пузыря стадии T1, то есть без инвазии в мышечный слой стенки органа.

Сформированы три группы исследования: НУРМП без рецидивирования — I группа (14 случаев), НУРМП с рецидивированием без прогрессии — II группа (14 случаев) и НУРМП с рецидивированием и прогрессией в виде инвазии в мышечный слой стенки — III группа (14 случаев). В каждую из групп было включено равное число опухолей низкой степени злокачественности (НСЗ) — по 8 случаев и высокой степени злокачественности (ВСЗ) — по 6 случаев.

Иммуногистохимическое исследование проводилось с использованием первичных моноклональных антител фирмы DAKO (Дания), Rady-to-Use к коллагену IV типа, ММР-9 и Ki-67. Показатели экспрессии маркеров, связанных с иммунным ответом, изучали в трех полях зрения микроскопа на гистологических срезах с наиболее выраженной экспрессией при увеличении ×400. Подсчет количества экспрессирующих маркеры клеток проводился на микроскопе Primo Star с фотокамерой при увеличении объектива ×400 с помощью программы Adobe Photoshop CS6. Площадь тестирования составила 0,057 мм² (57 000 мкм²). Для оценки иммуногистохимической реакции использовали полуколичественную шкалу от 0 до 3 с учетом процента экспрессирующих маркер клеток в поле зрения. Реакция на Ki-67: 1 балл — до 20% опухолевых клеток в поле зрения, 2 балла — 20–50% опухолевых клеток, 3 балла — более 50% опухолевых клеток. Реакция на коллаген IV типа: 0 — отсутствие реакции или экспрессия в менее 5% площади опухоли, 1 балл — слабая, прерывистая экспрессия маркера, 2 балла — непрерывное четкое окрашивание базальных мембран. Реакция на ММР-9: 1 балл — до 50% опухолевых клеток, 2 балла — более 50% опухолевых клеток различной степени интенсивности, 3 балла — интенсивная экспрессия 100% опухолевых клеток. Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета Statistica 6.0. Связь между признаками оценивалась по непараметрическому критерию χ Пирсона и критерию Спирмана. Статистически значимым считалось значение р<0,05.

Результаты и их обсуждение

Исследованные случаи НУРМП были представлены опухолями с различной гистоархитектоникой, дифференцировкой, особенностями инвазии. Как правило, новообразования имели папиллярную структуру с экзофитным ростом, сохраненной базальной мембраной, демонстрирующей хорошо выраженную экспрессию коллагена IV типа на границе со стромой. Такого рода папиллярные гистоструктуры, часто сливного характера, присутствовали в НУРМП НСЗ. Выраженные изменения гистоархитектоники сопровождались уменьшением площади стромального компонента, участками солидного строения, зонами инвазии в подслизистую основу (lamina propria) и гетерогенной реакцией коллагена IV типа, исчезновение которой чаще было характерно для зон пальцевидной инвазии, но наблюдалось и при фронтальном росте опухоли. Реакция на коллаген IV типа зависела от дифференцировки НУРМП. Так, 42,9% (18/42) опухолей характеризовались отсутствием экспрессии коллагена IV типа в участках инвазии, при этом в НУРМП ВСЗ отсутствие коллагена IV типа было в 77,8% (14/18), а в НУРМП НСЗ — в 41,7% (10/24) случаев (c=5,47, р<0,01).

Анализ экспрессии коллагена IV в группах исследования показал, что во II и III группах по сравнению с I отмечалось увеличение количества случаев с отрицательной экспрессией маркера, однако достоверных различий не выявлено (таблица).

Таблица. Распределение экспрессии коллагена IV типа, ММР-9, Ki-67 в НУРМП в зависимости от их принадлежности к группам исследования
Маркер, экспрессия Группы Достоверность, критерий χ
I, n (%)
n=14
II, n (%)
n=14
III, n (%)
n=14
Коллаген IV типа 0
1+
2+
6 (42,9)
8 (57,1)
0
8 (57,1)
6 (42,9)
0
10 (71,4)
4 (28,6)
0
χ=2,33;
р=0,31
(χ_crit=5,99)
Ki-67 0
1+
2+
3+
0
10 (71,4)
4 (28,6)
0
0
5 (35,7)
8 (57,1)
1 (7,2)
0
2 (14,3)
10 (71,4)
2 (14,3)
χ=10,31;
р=0,03
(χ_crit=9,48)
ММР-9 0
1+
2+
3+
0
8 (57,1)
4 (28,6)
2 (14,3)
0
4 (28,6)
4 (28,6)
6 (42,8)
0
2 (14,3)
4 (28,6)
8 (57,1)
χ=7,5;
р=0,11
(χ2_crit=9,48)

НУРМП характеризовался различной пролиферативной активностью опухолевых клеток. Уровень экспрессии Ki-67 в среднем составил 30,71±5,11% и зависел от дифференцировки опухоли. Так, все случаи рака с пролиферативной активностью 3+ были среди НУРМП ВСЗ, а низкая пролиферативная активность (1+) была характерна для НУРМП НСЗ (χ=15,9; р<0,0001). Различия между НУРМП НСЗ и НУРМП ВСЗ по уровню экспрессии Ki-67 достоверны (χ=17,36; р<0,0001). Полученные результаты согласуются с данными научной литературы [7] и являются закономерными, поскольку дифференцировка НУРМП определяется уровнем митотической активности, а следовательно, зависит и от процента клеток, экспрессирующих Ki-67. По данным некоторых авторов, маркер пролиферативной активности Ki-67 является критерием прогноза прогрессии заболевания и выживаемости пациентов [8], однако сведения противоречивы [9].

Выявлена слабая зависимость между уровнем экспрессии Ki-67 и принадлежности опухоли к группам исследования (χ=10,31; р<0,03). Экспрессия Кi-67 1+ была характерна для НУРМП I группы (χ=8,3; р<0,005), не характерна для III группы (χ=5,9; р<0,03), выраженная экспрессия (3+) была присуща III группе (χ=5,8; р<0,03). Однако зависимость между изученным маркером и принадлежностью опухоли к группам исследования была слабой (р=0,03) за счет достоверно значимого различия между I и III группами (χ=9,9; p=0,007), в то время как достоверно значимого различия между I и II группами не наблюдалось (χ=4; p=0,13). Полученные данные в целом указывают на ограниченное значение этого маркера для прогноза рецидивирования и прогрессии.

Прослежена обратная корреляционная связь между уровнем экспрессии Ki-67 и коллагена IV (r=–0,755; р<0,01). Так, в НУРМП со слабой экспрессией Ki-67 экспрессия коллагена IV типа была хорошо выражена, а по мере возрастания экспрессии Ki-67 в опухолях, демонстрирующих возрастание инвазивных свойств и снижение дифференцировки, экспрессия коллагена IV типа снижалась.

Средняя экспрессия ММР-9 составила 2,04±0,26. Опухолевые клетки, которые более интенсивно окрашивались маркером, отличались более выраженной клеточной атипией. Прослежена зависимость уровня экспрессии ММР-9 и дифференцировки НУРМП (χ=11,86; р=0,002). Выраженный уровень экспрессии был характерен для НУРМП ВСЗ (χ=4,0; р<0,05) и отмечался в 55,6% (10/18) случаев этой дифференцировки. Образцы нерецидивирующего НУРМП (I группы) характеризовались наиболее слабой реакцией на ММР-9 при сравнении с опухолями, давшими рецидивы с прогрессией (III группой), различия достоверны (χ=7,2; р<0,03). Слабый уровень экспрессии ММР-9 (1+) был характерен для I группы (χ=5,3; р<0,03). В целом полученные результаты согласуются с данными других авторов. Высокая экспрессия ММР является критерием прогноза рецидивирования, низкой общей выживаемости пациентов и выживаемости, связанной с прогрессией рака [10, 11].

Прослежена прямая корреляционная связь между уровнем экспрессии ММР-9 и Ki-67 (r=0,783; р<0,01). Таким образом, обнаружена прямая зависимость между возрастанием способности раковых клеток к продуцированию металлопротеиназ, разрушающих компоненты экстрацеллюлярного матрикса, и повышением пролиферативной активности опухоли, что обусловливает активный рост и распространение рака. Выявлена также обратная корреляционная зависимость между ММР-9 и коллагеном IV типа (r=–0,863, р<0,01), что согласуется со способностью ММР-9 разрушать коллаген IV типа и в целом указывает на взаимосвязь исследованных нами трех маркеров в процессах опухолевой прогрессии.

Выводы

1. Для НУРМП ВСЗ характерна экспрессия Ki-67 более 20% опухолевых клеток (р<0,0001), выраженная экспрессия MMP-9 (р<0,05) и отсутствие реакции на коллаген IV типа (р<0,01), что определяет эти маркеры как критерии злокачественности НУРМП.

2. В образцах нерецидивирующего НУРМП экспрессия Ki-67 и ММР-9 ниже, чем в опухолях рецидивирующего с прогрессией НУРМП (р<0,01 и р<0,03 соответственно). Слабая экспрессия ММР-9 и Ki-67 (до 20% опухолевых клеток) характерна для нерецидивирующего НУРМП (р<0,03 и р<0,005 соответственно), выраженная экспрессия Ki-67 (более 50% опухолевых клеток) — для рецидивирующего с прогрессией НУРМП (р<0,03).

3. Прослежена прямая корреляционная зависимость между экспрессией Ki-67 и ММР-9 (р<0,01) и обратная зависимость между экспрессией Ki-67 и коллагена IV типа (р<0,01), ММР-9 и коллагена IV типа, что характеризует взаимосвязь процессов повышения пролиферативной активности раковых клеток с возрастанием их способности к продуцированию металлопротеиназ и разрушению экстрацеллюлярного матрикса, и коллагена IV типа в частности. Эти изменения приводят к более агрессивному биологическому поведению опухоли и могут служить критериями прогноза заболевания.

Список использованной литературы

  1. Nagata M., Muto S., Horie S. (2016) Molecular biomarkers in bladder cancer: novel potential indicators of prognosis and treatment outcomes. Dis. Markers., 2016: 8205836. doi: 10.1155/2016/8205836
  2. Gschwend J.E., Dahm P., Fair W.R. (2002) Disease specific survival as endpoint of outcome for bladder cancer patients following radical cystectomy. Eur. Urol., 41: 440–448. doi: 10.1016/S0302-2838(02)00060-X
  3. Ogata D.C., Marcondes C.A., Tuon F.F. et al. (2012) Superficial papillary urothelial neoplasms of the bladder (PTA E PT 1): Correlation of expression of P53, Ki-67 and CK 20 with histologic grade, recurrence and tumor progression. Rev. Col. Bras. Cir., 39: 394–400. doi: 10.1590/S0100-69912012000500010
  4. Enache M., Simionescu C., Lascu L.C. (2012) Ki67 and Bcl-2 immunoexpression in primitive urothelial bladder carcinoma. Rom. J. Morphol. Embryol., 53(3): 521–525. PMID: 22990542
  5. Mannello F., Tonti G., Papa S. (2005) Matrix metalloproteinase inhibitors as targets of anticancer therapeutics. Curr. Cancer Drug Targets., 5: 285–298. DOI: 10.2174/1568009054064615
  6. Brunner A., Tzankov A. (2007) The role of structural extracellular matrix proteins in urothelial bladder cancer (review). Biomarker Insights., 2: 418. PMID: 19662222, PMCID: PMC2717820
  7. Ahn C., Jeong C.W., Kwak C. et al. (2018) Ki-67 as a prognostic marker in upper urinary tract urothelial carcinoma: a systematic review and meta-analysis. Clin. Genitourin. Cancer, 16(4): 1–9. doi: 10.1016/j.clgc.2018.02.010
  8. Wu P., Liu S., Zhang W. et al. (2015) Low-level Ki-67 expression as an independent predictor of bladder tumour recurrence in patients with primary upper tract urothelial carcinoma after radical nephroureterectomy. Jpn J. Clin. Oncol., 45(12): 1175–1181. doi: 10.1093/jjco/hyv139
  9. Yalçin Ö., Sağlican Y., Özdemir S. et al. (2015) The relationship of p16, Ki-67, Bcl-2, P53 and CK20 immune expressions with recurrence in superficial bladder tumors. World J. Pathol., 8: 44–51. http://www.npplweb.com/wjp/content/4/8
  10. Wu G.J., Bao J.S., Zeng F.C. et al. (2018) Elevated expression of matrix metalloproteinase-9 is associated with bladder cancer pathogenesis. J. Cancer Res. Ther., 14(Suppl.): S54–S59. doi: 10.4103/0973-1482.163761
  11. Chenkui M., Chao L., Jundong Z. et al. (2017) Prognostic role of matrix metalloproteinases in bladder carcinoma: a systematic review and meta-analysis. Oncotarget, 8(19): 32309–32321. doi: 10.18632/oncotarget.15907
Адрес:
Титов Евгений Вячеславович
61000, Харьков, ул. Амосова, 58
Харьковская медицинская академия последипломного образования
E-mail: titovevgeniy@ukr.net

Correspondence:
Titov Evgeniy
58 Amosova str., Kharkiv 61000
Kharkiv Medical Academy of Postgraduate Education
E-mail: titovevgeniy@ukr.net

Коментарів немає » Додати свій
Leave a comment