Одержано 24.05.2019

Прийнято до друку 26.06.2019

DOI: 10.32471/clinicaloncology.2663-466X.39.22677

Вступ

Тричі негативний рак грудної залози (ТНРГЗ) — це група гетерогенних пухлин, яка не має рецепторів до естрогенів, прогестерону та гіперекспресії HER2/neu. Виживаність у цій групі найнижча порівняно з будь-яким іншим молекулярним підтипом раку грудної залози (РГЗ), лікування якого залишається однією з найбільших проблем сучасної онкології [1, 4, 5]. Єдиним затвердженим на сьогодні методом лікування при ТНРГЗ залишається поліхіміотерапія [1, 4, 5]. Незважаючи на негативний прогноз в цілому для пацієнток з ТНРГЗ, існує підгрупа хворих з кращою відповіддю на системну поліхіміо­терапію та кращим прогнозом, що доводить гетерогенність ТНРГЗ.

Тол-подібні рецептори (toll like receptors — TLR) — це сімейство трансмембранних рецепторів вродженого імунітету, які розпізнають ліганди бактеріального, грибкового, паразитарного та вірусного походження і переважно розташовані на різних клітинах імунної системи, дендритних клітинах, макрофагах та NK-клітинах [6]. Вони відіграють ключову роль у реалізації механізмів вродженої та набутої імунної відповіді, беручи участь в регуляції запалення та активації адоптивних імунних шляхів у відповідь на інфекційні патогени або антигени злоякісних клітин [6, 9].

У людини вивчено 10 типів тол-подібних рецепторів (TLR-1–10), які розподілені на дві групи відповідно до їх локалізації [9].

Кожен підтип тол-подібних рецепторів розпізнає специфічний ліганд: TLR-2 — бактеріальні ліпопротеїди, TLR-3 — двохниткові вірусні РНК, TLR-7 — однониткові вірусні РНК, а TLR-9 — CpG ділянки ДНК. TLR-4 ефективно розпізнає ліпополісахариди або ендотоксин, який експресують грамнегативні бактерії, а TLR-5 — бактеріальний флагелін. Експресія TLR-10, для якого не виявлено специфічного ліганду, значно виражена в селезінці та В-лімфоцитах. Згідно з багатьма даними літератури, очевидною постає роль тол-подібних рецепторів у процесі розвитку РГЗ та еволюції його мікрооточення. Дані щодо високої експресії TLR не тільки на імунокомпетентних клітинах пухлинного мікрооточення, але й на самих клітинах РГЗ отримано багатьма дослідниками [6–8].

TLR-4 відіграє важливу роль у процесах міграції клітин, в тому числі стимулює інвазивність клітин РГЗ. Результати клінічних досліджень свідчать про значний взаємозв’язок між гіперекспресією TLR-4, розмірами первинної пухлини, ураженням лімфовузлів при РГЗ [2, 3]. TLR-9 також експресується клітинами РГЗ, а його вплив на інвазивний потенціал злоякісних клітин регулюється стероїдними статевими гормонами та залежить від експресії рецепторів цих гормонів на клітинах РГЗ [7]. Результати значної кількості наукових робіт вказують на зв’язок різних варіантів генетичних поліморфізмів тол-подібних рецепторів з ризиком розвитку РГЗ, його розповсюдженістю, а також відповіддю пухлини на хіміотерапію [8–11].

Враховуючи поширеність та соціальну значущість РГЗ у всьому світі, вивчення прогностичної та предиктивної ролі тол-подібних рецепторів та їх поліморфізмів є актуальним питанням сучасної онкології. Не менш важливим є глибше розуміння ролі тол-подібних рецепторів у процесах пухлинної прогресії, ухилення від контролю з боку імунної системи, а також у виникненні резистентності до різних видів протипухлинного лікування.

Метою дослідження є визначення прогностичної ролі поліморфізму генів TLR-2, TLR-4 та TLR-9 у пацієнток із метастатичним ТНРГЗ.

Об’єкт і методи дослідження

Проведено аналіз результатів лікування 101 пацієнтки з метастатичним ТНРГЗ. Визначення поліморфізму генів TLR-2 (G753A), TLR-4 (C399T) та TLR-9 (G2848A) виконували за допомогою методу полімеразної ланцюгової реакції з аналізом поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів (ПЛР — ПДРФ). Геномну ДНК виділяли з периферичної крові за допомогою комерційної тест-системи NucleoSpin® BloodQuickPure (Macherey-Nagel, Німеччина) відповідно до інструкції виробника. Необхідні фрагменти генів TLR-2 (rs5743708), TLR-4 (rs4986791) та TLR-9 (rs352140) ампліфікували за допомогою комерційного набору TaqManUniversal PCR MasterMix (ThermoScientific, США) з використанням специфічних олігонуклеотидних праймерів. Відповідно до ПДРФ-аналізу зони розміром 228, 75 і 40 п.о. відповідали гомозиготному генотипу TLR-2 G/G; 268, 228, 75, 40 п.о. діапазони були позначені як гетерозиготні особи G/A; смуги 268, 75 п.о. відповідали поліморфному варіанту гена А/А. Зони 406 п.о. відповідали TLR-4 C/C; 406, 377, 29 п.о. зони були позначені як гетерозиготні особи C/T; зони 377, 29 п.о. відповідали гомозиготному генотипу T/T. Смуги 135, 42 п.о. відповідали TLR-9 G/G; 177, 135, 42 п.о. зони були позначені як гетерозиготні особи G/A; смуга 177 п.о. відповідала гомозиготному генотипу A/A.

Математичну обробку отриманих даних проводили з використанням пакета програм MedCalc. У рамках дослідження використовували методи дескриптивної статистики. Проведено аналіз асоціацій для 4 генів (для оцінки ступеня зв’язку розраховувався коефіцієнт V Крамера). Відмінності між вибірками, що розподілені за нормальним законом, оцінювалися за параметричним критерієм Стьюдента (t), для порівняння рангових ознак використано критерій W-Вілкоксона; для порівняння якісних ознак — точний критерій Фішера та критерій χ. Також застосовувався однофакторний дисперсійний аналіз (у випадку нормального закону розподілу) або критерій Крускала — Уолліса (у випадку закону розподілу, відмінного від нормального). При проведенні апостеріорних попарних порівнянь використано методи множинних порівнянь.

Результати

Нами вивчено поліморфізм генів TLR-2 (G753A), TLR-4 (C399T), TLR-9 (G2848A) у 101 хворої на метастатичний ТНРГЗ (табл. 1). При встановленні розповсюдженості мутацій генів тол-подібних рецепторів 2-го, 4-го та 9-го типів виявлено, що генотип GC за геном TLR-2 (G753A) був у 33 (33%), генотип GG — у 7 (7%), а генотип GG — у 60 (60%) пацієнток; генотип СС за геном TLR-4 (C399T) — у 71 (70,3%) пацієнтки, генотип СТ — у 25 (24,8%), а генотип ТТ за геном TLR-4 (C399T) — у 5 (5%) пацієнток. Вивчення поліморфізму гена TLR-9 (G2848A) виявило генотип GA у 50 (49,5%) пацієнток; генотип АА — у 37 (36,6%), а генотип GG — у 14 (13,9%) хворих на метастатичний ТНРГЗ.

Також ми дослідили асоціацію поліморфізму генів тол-подібних рецепторів 2-го, 4-го та 9-го типів з особливостями перебігу ТНРГЗ. Як видно з табл. 2, у нашому дослідженні не виявлено асоціації мутацій гена TLR-2 (G753A) з розміром первинної пухлини (категорія рТ згідно з класифікацією TNM), статусом аксилярних лімфатичних вузлів (категорія рN за класифікацією TNM), стадією захворювання та станом менструальної функції у пацієнток із метастатичним ТНРГЗ. Натомість, при дослідженні рівня проліферативної активності пухлини за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу встановлено статистично достовірний взаємозв’язок між поліморфізмом гена TLR-2 (G753A) та індексом проліферативної активності Кі-67 у післяопераційному матеріалі (табл. 3).

Для порівняння рангових ознак використано критерій Крускала — Уолліса; для порівняння якісних ознак використано критерій χ. *Пременопауза; менопауза.

Для порівняння використано однофакторний дисперсійний аналіз.

Дослідження асоціації поліморфізму гена TLR-2 (G753A) та рівня проліферативної активності пухлини Кі-67 у післяопераційному матеріалі хворих на ТНРГЗ за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу виявило статистично достовірний взаємозв’язок (р=0,03). Так, у хворих на ТНРГЗ — носіїв генотипу GC за геном TLR-2 (G753A) середні значення індексу Кі-67 у післяопераційному матеріалі були нижчими порівняно з хворими — носіями генотипів GG та СС за цим геном і становили 35,8±17,3%; 46,3±24,1% та 59,3±31,2% відповідно.

Також було вивчено взаємозв’язок молекулярно-генетичних особливостей за геном TLR-4 (С399Т) з перебігом захворювання у пацієнток із ТНРГЗ. Проведений аналіз не виявив асоціації мутацій гена TLR-4 (С399Т) з розміром первинної пухлини (категорія рТ за класифікацією TNM), статусом аксилярних лімфатичних вузлів (категорія рN за класифікацією TNM), стадією захворювання та станом менструальної функції у пацієнток із метастатичним ТНРГЗ. Також не відмічено відмінностей за розподілом мутантних алелей (табл. 4).

Для порівняння рангових ознак використано критерій Крускала — Уолліса; для порівняння якісних ознак використано критерій χ: *пременопауза; менопауза.

Як видно з табл. 5, дослідження асоціації поліморфізму гена TLR-4 (С399Т) та рівня проліферативної активності пухлини Кі-67 у післяопераційному матеріалі хворих на ТНРГЗ за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу виявило статистично достовірний взаємозв’язок (р=0,02). Так, у хворих на ТНРГЗ — носіїв генотипу ТТ за геном TLR-4 (С399A) середні значення індексу Кі-67 у післяопераційному матеріалі були вищими (72,8±15,8%) порівняно з хворими — носіями генотипів СС та СТ за цим геном (40,3±21,8% та 45,7±24,1% відповідно).

Для порівняння використано однофакторний дисперсійний аналіз. При проведенні апостеріорних попарних порівнянь використано методи множинних порівнянь: *відмінність від групи з мутацією СС статистично значуща (p<0,05); #відмінність від групи з мутацією СT статистично значуща (p<0,05); &відмінність від групи з мутацією TT статистично значуща (p<0,05).

Проведений аналіз не виявив асоціації мутацій гена TLR-9 (G2848A) з розміром первинної пухлини (категорія рТ за класифікацією TNM) та статусом аксилярних лімфатичних вузлів (категорія рN за класифікацією TNM), стадією захворювання та індексом проліферативної активності пухлини Кі-67 в матеріалі трепан-біопсії та у післяопераційному матеріалі хворих на ТНРГЗ. Також не відмічено відмінностей за розподілом мутантних алелей за геном TLR-9 (G2848A) у різних вікових групах хворих на метастатичний ТНРГЗ та залежно від стану менструальної функції.

При вивченні асоціації поліморфізму генів TLR-2 (G753A), TLR-4 (C399T) та TLR-9 (G2848A) у цієї категорії хворих досліджено асоціацію поліморфізму вищезазначених генів із такими маркерами імунного мікрооточення пухлини, як рівень пухлина-інфільтруючих лімфоцитів (ПІЛ), стромальних та перитуморальних CD4, CD8 та FOXP3 лімфоцитів до та після оперативного лікування.

У нашому дослідженні (табл. 6) виявлено асоціацію поліморфізму гена TLR-2 (G753A) з рівнем ПІЛ у хворих на ТНРГЗ (р=0,02). Визначено, що у більшості хворих (66%) — носіїв генотипу СС за геном TLR-2 (G753A) виявлено пухлини без лімфоїдної інфільтрації (ПІЛ 0), помірна лімфоїдна інфільтрація (ПІЛ2) відмічена у 33% пацієнток, а пухлини з вираженою лімфоїдною інфільтрацією ПІЛ3 у цій групі не траплялися. Протилежні закономірності були виявлені у хворих — носіїв генотипів GС та GG за геном TLR-2 (G753A). Так, виражену лімфоїдну інфільтрацію ПІЛ3 встановлено у 36,6% хворих — носіїв генотипу GС та у 30% хворих — носіїв генотипу GG за геном TLR-2 (G753A).

Для порівняння використано критерій Крускала — Уолліса. При проведенні апостеріорних попарних порівнянь використані методи множинних порівнянь: *відмінність від групи з мутацією СС статистично значуща (p<0,05); #відмінність від групи з мутацією GС статистично значуща (p<0,05); &відмінність від групи з мутацією GG статистично значуща (p<0,05).

Взаємозв’язку поліморфізму гена TLR-2 (G753A) з іншими параметрами імунного мікрооточення не виявлено.

У пацієнток з метастатичним ТНРГЗ не встановлено взаємозв’язку між поліморфізмом генів TLR-4 (С399Т), TLR-9 (G2848A) та рівнем ПІЛ, стромальних та перитуморальних CD4, CD8 та FOXP3 лімфоцитів до та після оперативного лікування.

Для оцінки впливу поліморфізму генів TLR-2 (G753A), TLR-4 (C399T), TLR-9 (G2848A) на загальну та безрецидивну виживаність проведено аналіз результатів лікування 101 хворої на ТНРГЗ шляхом побудови однофакторних моделей пропор­ційних інтенсивностей Кокса та розрахунку співвідношення ризиків з 95% довірчим інтервалом (ДІ).

Проведений аналіз не виявив незалежного прогностичного впливу поліморфізму генів TLR-2 (G753A), TLR-9 (G2848A) на загальну та безрецидивну виживаність хворих на ТНРГЗ. Також не зафіксовано незалежного прогностичного впливу поліморфізму гена TLR-4 (С399Т) на загальну виживаність. Натомість у результаті однофакторного аналізу з використанням моделі пропорційних інтенсивностей Кокса встановлено вплив мутації гена TLR-4 (С399Т) на безрецидивну виживаність хворих на ТНРГЗ.

Як видно з табл. 7, у пацієнток із ТНРГЗ — носіїв генотипу СС за геном TLR-4 (С399Т) ризик рецидиву захворювання був нижчий у 3,75 раза (відношення ризиків (ВР) 0,28; 95% ДІ 0,10–0,80) порівняно з носіями генотипу ТТ за цим геном. Також виявлено зниження ризику розвитку віддалених метастазів у носіїв генотипу СТ за геном TLR-4 (С399Т) (ВР 0,24; 95% довірчий інтервал 0,08–0,74) у 4 рази порівняно з хворими — носіями генотипу ТТ за геном TLR-4 (С399Т).

Висновки

За допомогою однофакторного дисперсійного аналізу доведено асоціацію поліморфізму гена TLR-4 (С399Т) та рівня проліферативної активності пухлини Кі-67 у післяопераційному матеріалі хворих на ТНРГЗ (р=0,02). Виявлено асоціацію поліморфізму гена TLR-2 (G753A) з рівнем ПІЛ у пацієнток із метастатичним ТНРГЗ (р=0,02). Встановлено, що ризик розвитку рецидиву у хворих на ТНРГЗ був найвищим у носіїв генотипу ТТ за геном TLR-4 (C399T) порівняно з носіями генотипу СС (ВР 0,28; 95% ДІ 0,10–0,80) та носіями генотипу СТ (ВР 0,24; 95% ДІ 0,08–0,74) відповідно (p=0,01).

Список використаної літератури

1. Anders, C. K., Abramson, V., Tan, T., & Dent, R. (2016). The evolution of triple-negative breast cancer: from biology to novel therapeutics. American Society of Clinical Oncology Education Book, 35, 34–42. doi:10.1200/EDBK_159135.
2. Ahmed, A., Redmond, H. P., & Wang, J. H. (2013). Links between Toll-like receptor 4 and breast cancer. Oncoimmunology, 2, e22945. doi: 10.4161/onci.22945.
3. Bhattacharya, D., & Yusuf, N. (2012). Expression of toll-like receptors on breast tumors: taking a toll on tumor microenvironment. International Journal of Brest Cancer, 12, 716–724. doi: 10.1155/2012/716564.
4. Dana, A., Franzese, E., Centonze, S., Carlino, F., Della Corte, C. M., Ventriglia, J., … Orditura, M. (2018). Triple-negative breast cancers: systematic review of the literature on molecular and clinical features with a focus on treatment with innovative drugs. Current Oncology Reports, 20(10), 76. doi: 10.1007/s11912-018-0726-6.
5. Hudis, C., & Gianni, L. (2011). Triple negative breast cancer: an unmet medical need. The Oncologist, 28(2), 135–146. doi: 10.1634/theoncologist.2011-S1-01.
6. Kawai, T., & Akira, S. (2013). The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors. Nature Immunology, 11, 373–384. doi: 10.1038/ni.1863.
7. Qiu, J., Shao, S., Yang, G., Shen, Z., & Zhang, Y. (2011). Association of Toll like receptor 9 expression with lymph node metastasis in human breast cancer. Neoplasma, 58, 251–255.
8. Sun, L., Jiang, Q., Zhang, Y., Liang, H., Ren, H., & Zhang, D. (2016). Toll-like receptors and breast cancer. Integrative Cancer Science and Therapeutics, 3(2), 432–436. doi: 10.15761/ICST.1000183.
9. Wang, R. F., Miyahara, Y., & Wang, H. Y. (2008). Toll-like receptors and immune regulation: implications for cancer therapy. Oncogene, 27, 181–189. doi: 10.1038/sj.onc.1210906.
10. Yang, C. X., Li, C. Y., & Feng, W. (2012). Toll-like receptor 4 genetic variants and prognosis of breast cancer. Tissue Antigens, 8, 221–226. doi: 10.1111/tan.12096.
11. Zhu, L., Yuan, H., Jiang, T., Wang, R., Ma, H., Zhang, S. (2013). Association of TLR-2 and TLR-4 polymorphisms with risk of cancer: a meta-analysis. PLoS ONE, 8(12), 828–858. doi: 10.1371/journal.pone.0082858.

Коментарів немає » Додати свій

Leave a comment

Ім’я (required)

Mail (will not be published) (required)

Сайт

CAPTCHA Code